Работа 6. Изучение потенциала действия

на компьютерной модели гигантского аксона кальмара

(модель Ходжкина–Хаксли)

При обучении студентов основам нейрофизиологии используются методики компьютерного моделирования, которые находят все большее применение в учебных курсах. Удачным примером такой компьютерной программы является программа "NeuroSim", разработанная английской фирмой BioSoft. Эта программа применяется как на начальных этапах обучения основам электрофизиологии, так и при более глубоком освоении материала студентами старших курсов. Программа создает полную иллюзию самостоятельного выполнения таких экспериментов, как внутриклеточная регистрация потенциала, измерение токов методом «фиксации потенциала», апплицирование различных блокаторов и изменение концентрации электролитов. При этом экран компьютера выполняет функции экрана осциллографа. Вся программа включает пять экспериментов: изучение свойств потенциала действия гигантского аксона кальмара на модели Ходжкина–Хаксли, анализ синаптической передачи, регистрацию токов через отдельный канал, моделирование работы нейронной сети, изучение кабельных свойств нервного волокна.

Цель работы: изучение свойств потенциала действия гигантского аксона кальмара на компьютерной модели Ходжкина–Хаксли.

Объект исследования: лягушка.

Ход работы. Запустите программу. Слева на экране отражено меню команд, справа – таблица с текущими параметрами эксперимента.

Режим <Фиксация потенциала> должен быть выключен. Первую часть работы выполняйте при постоянной длительности раздражающего стимула, равной 0,5 мс. Второй раздражающий стимул в начале работы должен быть выключен (его амплитуда равна нулю). Для изменения параметров стимула с помощью клавиш управления курсором (клавиши со стрелками <вверх> и <вниз>) выберите в меню команд пункт <Стимул>, при появлении курсора в правой части экрана введите необходимые числовые параметры и нажмите клавишу <Enter>.

Для возвращения в главное меню нажмите клавишу <Esc>.

Запустите выполнение эксперимента с текущими параметрами. Для этого в меню команд выберите пункт <Опыт> и нажмите клавишу <Enter>.

На экране (сверху вниз) отражены следующие кривые (треки):

1) изменение мембранного потенциала (в мВ);

2) стимулирующий ток (в мкА/см²);

3) ток ионов Na⁺, К⁺ и суммарный ток через мембрану
(в мкА/см²);

4) изменение проводимости для ионов Na⁺ и К⁺
(в См/см²).

Как видно из приведенной картины, при исходных параметрах эксперимента на изолированном аксоне кальмара возникает потенциал действия.

Задание 1. Определение порога возникновения ПД

гигантского аксона кальмара

Нажав клавишу <Esc>, выйдите в главное меню. Выберите команду <Стимул>. Уменьшите амплитуду первого стимула на 10 мкА. Нажмите клавишу <Esc>. Выберите команду <Опыт>. Продолжайте уменьшение амплитуды стимула до тех пор, пока при нанесении раздражения ПД не будет развиваться. Постепенно увеличивая силу стимула, точно определите величину порога раздражения.

Задание 2. Изучение зависимости амплитуды ПД

гигантского аксона кальмара от силы стимула

Градуально увеличивая амплитуду стимула от выявленной в предыдущем задании величины порога до 100 мкА с шагом 10 мкА, измерьте амплитуду ПД с помощью курсора. Для этого с помощью стрелок управления курсором установите его на вершине ПД и занесите в таблицу 2 параметры напряжения (в мВ), отображенные в правой части экрана.

Обратите внимание на изменение латентного периода развития ПД при увеличении силы стимула и объясните это явление.

Таблица 2. Зависимость амплитуды ПД от силы стимула

Амплитуда стимула мкА	Порог	20	30	40	50	60	70	80	90	100	Порог
Амплитуда ПД, мВ

Сравните графики зависимости амплитуды ПД седалищного нерва лягушки от силы стимула с графиком зависимости амплитуды ПД гигантского аксона кальмара от силы стимула и объясните причину их различий.

Задание 3. Исследование зависимости порога раздражения

от длительности стимула

Выйдите в меню команд. Выберите команду <Стимул>. Установите длительность стимула 0,05 мс. Меняя амплитуду стимула, определите порог возникновения ПД при этой длительности. Продолжайте увеличивать длительность стимула, определяя порог возникновения ПД, данные заносите в таблицу 3.

Таблица 3. Зависимость порога возникновения ПД

от длительности стимула

Длительность стимула, мс	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
Величина порога, мкА
Длительность стимула, мс	2,0	3,0	4,0	5,0	6,0	7,0	8,0
Величина порога, мкА

На основании полученных данных постройте график зависимости порога раздражения от длительности стимула, рассчитайте величину хронаксии, реобазы и полезного времени. Объясните полученные данные.

Задание 4. Определение длительности фазы относительной и абсолютной рефрактерности для гигантского

аксона кальмара

Установите следующие параметры стимула:

Первый стимул – амплитуда – 50 мкА, длительность – 0,5 мс, интервал между импульсами – 10 мс;

Второй стимул – амплитуда – 11,2 мкА (амплитуда порога при данной длительности стимула), длительность – 0,5 мс.

Запустите команду <Опыт>. Убедитесь, что второй стимул не вызывает появления потенциала действия, и вернитесь в главное меню, нажав клавишу <Esc>.

Увеличивайте интервал между импульсами с шагом 1 мс до тех пор, пока не появится второй ПД. Этот интервал равен периоду относительной рефрактерности (ОРФ).

В период абсолютной рефрактерности (АРФ) никакой стимул не может вызвать развития ПД. Для его определения постепенно уменьшайте интервал между импульсами до тех пор, пока не исчезнет второй ПД; чтобы удостовериться, что найден период абсолютной рефрактерности, увеличьте амплитуду стимула до 500 мкА. Если второй ПД появился снова, продолжайте уменьшать интервал между стимулами. Обратите внимание, что второй потенциал действия должен сопровождаться повышением натриевой и калиевой проводимости, в противном случае Вы наблюдаете лишь артефакт стимуляции, обусловленный пассивными электрическими свойствами мембраны. Если второй импульс уже не вызывает повышения проводимости Na⁺ и входящего натриевого тока, значит он попадает в фазу абсолютной рефрактерности.

Задание 5. Влияние тетродотоксина (ИХ),

тетраэтиламмония (TEA) и вератридина на потенциал действия гигантского аксона кальмара

Установите параметры стимулов, как в Задании 1. Запустите эксперимент с текущими параметрами и распечатайте результат, нажав клавишу F2.

Для имитирования действия различных блокаторов в эксперименте в меню команд выберите пункт <В-ва> (Вещества). Нажмите клавишу <Y> (Yes) напротив выбранного препарата. Нажмите клавишу <Enter> и запустите эксперимент командой <Опыт>.

Необходимо помнить, что в учебной программе не учитывается дозозависимость эффектов препаратов. Предполагается, что они полностью блокируют соответствующие структуры.

Последовательно проследите эффекты:

1. блокатора натриевых каналов тетродотоксина (ТТХ);

2. блокатора калиевых каналов тетраэтиламмония (TEA);

3. блокатора натриевой инактивации вератридина.

Перед проведением эксперимента с вератридином с помощью команды <Шкала> измените масштаб шкалы проводимости с 50 до 200 (См/см²), а шкалу ионного тока с ±1000 до ±4000 (мкА/см²).

Распечатайте полученные результаты, сравните с исходными графики изменения потенциала, токов и проводимостей для ионов Na⁺ и К⁺ на фоне блокаторов. Объясните полученные результаты.

Дополнительное задание. Исследование зависимости амплитуды ПД гигантского аксона от наружной концентрации ионов Na⁺.

Установите следующие параметры раздражающего стимула: первый стимул: амплитуда – 100 мкА, длительность – 0,5 мс; амплитуда второго стимула должна быть равна нулю (стимул выключен).

Запустите выполнение эксперимента с текущими параметрами. Не стирая результатов этого эксперимента (не нажимая клавишу <С>, Clear), выйдите в главное меню, нажав <Esc>.

С помощью команды <Ион. конц.> (Ионные концентрации) последовательно изменяйте наружную концентрацию ионов Na⁺ и с помощью курсора измерьте амплитуду второго стимула, которая должна быть равна нулю (стимул выключен).

Запустите выполнение эксперимента с текущими параметрами. Не стирая результатов этого эксперимента (не нажимая клавишу <С>, Clear), выйдите в главное меню, нажав <Esc>.

С помощью команды <Ион. конц.> (Ионные концентрации) последовательно изменяйте наружную концентрацию ионов Na⁺ и с помощью курсора измерьте амплитуду развивающихся потенциалов действия. Данные эксперимента занесите в таблицу 4.

Таблица 4. Зависимость амплитуды ПД гигантского аксона кальмара от наружной концентрации ионов натрия

Наружная концентрация ионов Na^+, мМ	836	418	209	105	52	26
Амплитуда ПД, мВ

Постройте график зависимости амплитуды ПД от десятичного логарифма наружной концентрации ионов Na⁺. Сравните полученные данные с теоретической прямой, рассчитанной по уравнению Нернста:

Е_Na = 581g ,

где E_Na – потенциал, создаваемый ионом натрия; 0 – концентрация ионов во внешней среде клетки; i – концентрация ионов внутри клетки.

Внутреннюю концентрацию ионов Na⁺ принимают равной 5 мМ.

Объясните полученные результаты.