Работа 7. Определение метгемоглобина

Гемоглобин обладает способностью образовывать патологические соединения: карбоксигемоглобин – соединение гемоглобина с угарным газом (Нb СО) и метгемоглобин (Мет Нb). Метгемоглобин является окисленным гемоглобином, в котором под влиянием сильных окислителей (феррицианид, нитрит натрия, перманганат калия, бертолетовая соль и др.) железо гема из двухвалентного превращается в трехвалентное. Накопление в крови метгемоглобина выше определенного уровня приводит к патологическому состоянию, которое называется метгемоглобинемией. Метгемоглобин прочно связывает кислород, нарушается транспорт кислорода по тканям, развивается гипоксия. Критический уровень метгемоглобина приводит к смерти.

Цель работы – определить содержание метгемоглобина в крови человека.

Для работы необходимы: 0,25%-ный раствор аммиака (NH₄ОН); калий железосинеродистый (феррицианид калия, соль кровяная красная); гепарин (25 000 ед.); химические пробирки; пипетки на 1,10 мл; фотоэлектроколориметр (ФЭК) с красным светофильтром.

Ход работы. Готовят 0,25%-ный раствор аммиака, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды. Насыщенный раствор феррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды, раствор хранят не более недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистиллированной воды.

Для анализа отбирают в пробирку 1 мл крови. Кровь стабилизируют, добавляя в пробирку 2–3 капли раствора гепарина.

При необходимости перевозки или хранения проб крови закрытые пробками пробирки с кровью помещают в термос со льдом или в морозильную камеру холодильника с температурой 12 ⁰С, кровь можно хранить в течение нескольких суток.

В две химические пробирки наливают по 7,3 мл
0,25%-ного раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой пробы (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка № 2) добавляют 1–2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, перемешивают содержимое пробирок и оставляют обе пробирки на 1 час. Через 1 час определяют величину оптической плотности обоих растворов крови на фотоэлектроколориметре (ФЭКе) в кюветах 10 мм при красном светофильтре, используя для сравнения 0,25%-ный раствор аммиака.

В первой пробирке (пробирка № 1) определяют величину светопоглощения раствора крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (Н_bО₂), во второй пробирке (пробирка № 2) – величину светопоглощения раствора крови, в которой весь оксигемоглобин превращен в метгемоглобин.

Содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.

Поскольку в пробирке № 2 весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощения раствора метгемоглобина зависит от исходного уровня гемоглобина, то есть оксигемоглобина.

У ФЭКов различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭКа-56 при работе с красным светофильтром № 8 длина волны составляет 597 нм, у ФЭКа-56 ПМ и ФЭК КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600–670 нм.

Определение светопоглощения растворов крови проводят с использованием ФЭКов различных марок при красном светофильтре, используя для сравнения 0,25%-ный раствор аммиака в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Различия, связанные с измерением экстинкций растворов крови при различающихся длинах волн при работе на ФЭКах различных марок, корригируют путем введения в расчетную формулу коэффициента – величины приведенной экстинкции (Е) раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина
(Е-Н_bО₂). При расчете используют измеренные величины светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка № 1) и метгемоглобина (пробирка № 2).

Пример. На молоди карповых рыб установлены средние величины светопоглощения раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (0,15) и полученным уровнем метгемоглобина (0,77).

Поскольку гемоглобин в пробе крови (пробирка № 2) полностью переводится в метгемоглобин, изменение светопоглощения равно 0,62 (0,77–0,15), соответствует 100 % содержанию метгемоглобина.

Эти данные необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови.

С этой целью на основании показателей светопоглощения растворов исследуемых проб крови (пробирка № 1 и № 2) рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенной формуле, используя установленный коэффициент и расчетное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн:

Х = (e2 – e1)×1, 61×100,

где Х – содержание (в %) метгемоглобина в исследуемой пробе крови; е2 – светопоглощение раствора оксигемоглобина (расчет приводится ниже); е1 – среднее значение величины светопоглощения раствора оксигемоглобина, равное 0,15; 1,61 – расчетный коэффициент, найденный из средних величин светопоглощения растворов оксигемоглобина и метгемоглобина (расчет см. ниже).

Значение е2 – светопоглощение раствора оксигемоглобина находят из пропорции:

е2/е3 = е4/е5, е2 = е3×е4/е5,

где е2 – искомая величина, значение оптической плотности раствора оксигемоглобина; е3 – среднее (для рыб) значение оптической плотности раствора метгемоглобина, равное 0,77; е4 – измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (пробирка № 1); e5 – измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина (пробирка № 2).

Полученное значение е2 подставляют в формулу для расчета содержания метгемоглобина в крови рыб.

Если значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (е2) равно или меньше средней величины оптической плотности раствора оксигемоглобина (е1 = 0,15) (объясняется индивидуальными колебаниями содержания гемоглобина в крови рыб), то содержание метгемоглобина будет равно или меньше 1,61 %.

Результаты работы и их оформление. Занести в рабочую тетрадь описание методики определения метгемоглобина и расчетные показатели. Сравнить найденную в работе величину метгемоглобина у рыб с нормой, учитывая их видовую принадлежность.