Работа 4. Изучение количественного соотношения

лейкоцитов (лейкоцитарная формула)

Количественные соотношения всех видов лейкоцитов периферической крови называют лейкоцитарной формулой, или лейкограммой. В нормальных условиях лейкоцитарная формула для человека довольно постоянна и представлена следующими соотношениями (%): базофилы – 0–1; эозинофилы – 0,5–5; нейтрофилы – 47–72; лимфоциты – 19–37; моноциты – 3–11. Нейтрофилы – самая большая группа лейкоцитов. В крови циркулирует не более 1 % имеющихся в организме нейтрофилов. Основная их часть сосредоточена в тканях. В зависимости от формы ядра нейтрофилы делятся на юные (метамиелоциты 1 %), палочкоядерные (1–5 %) и сегментоядерные (45–70 %). Функция нейтрофилов – защита организма от микробов, вирусов, токсинов. При некоторых физиологических, а особенно при патологических состояниях наблюдаются значительные колебания в общем числе лейкоцитов и в соотношении их форм. При увеличении количества незрелых форм в лейкоцитарной формуле говорят о сдвиге влево (индекс регенерации). Сдвиг вычисляют по отношению миелоцитов, юных и палочкоядерных форм к количеству сегментоядерных. В норме этот показатель равен 0,05–0,1. При тяжелых инфекционных заболеваниях и воспалительных процессах он может достигать 1–2. Эозинофилы способны разрушать и обезвреживать токсины белкового происхождения, чужеродных белков, комплексов антиген-антитело. Эозинофилы продуцируют фермент гистаминазу, разрушающую гистамин. Количество эозинофилов увеличивается при аллергических состояниях, глистной инвазии, антибактериальной терапии. Определение лейкоцитарной формулы используется при диагностике инфекционных, паразитарных и других заболеваний.

Цель работы – изучить соотношение гранулярных и агранулярных лейкоцитов.

Для работы необходимы: микроскоп; предметные и покровные стекла; одноразовые перчатки; стерильный скарификатор; спирт; йод; вата; фильтровальная бумага; красители.

Ход работы

1. Приготовление мазка крови. Мазок крови делают на обезжиренном предметном стекле с помощью покровного или шлифованного предметного стекла, которое должно быть несколько уже, чем стекло, на которое наносится мазок крови. Для обезжиривания предметные стекла промываются мылом в солевом растворе, а затем тщательно промываются струей проточной воды и досуха вытираются. Хранить стекла до употребления следует в банке со смесью Никифорова (эфир со спиртом в соотношении 1:1). Перед употреблением стекла вынимаются пинцетом и тщательно протираются.

После прокола пальца большим и средним пальцами левой руки следует взять предметное стекло за ребра и одним концом стекла прикоснуться к верхушке выступившей капли крови. Затем покровное (шлифовальное) стекло ставят впереди капли крови под углом 45⁰ к предметному стеклу и, подождав, пока капля крови расплывется вдоль его ребра, быстрым легким движением проводят им вперед, не отрывая от предметного стекла раньше, чем иссякнет вся кровь. Мазок должен быть достаточно тонким, немного короче и уже предметного стекла. Стеклянный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает. Высушивают мазок на воздухе.

Фиксация мазка. Мазок крови фиксируют в чашечке со спиртом или в смеси Никифирова. Если одновременно фиксируется несколько мазков, то стекла с мазком сложить попарно мазками наружу и установить наклонно. Через 5 мин мазки вынуть пинцетом и по одному установить в вертикальном положении на лист фильтровальной бумаги, фиксирующую жидкость влить в банку с притертой пробкой, где она может храниться неограниченное время. Фиксированные мазки следует сушить в термостате при 37 ⁰С.

Окраска мазка. Мазок окрашивают краской Романовского, представляющей собой азур-эозиновую смесь. Смесь метиленовой синьки и эозина при стоянии образует азур, который окрашивает протоплазму в синий цвет, ядра – в красный. Краска Романовского употребляется из расчета 2–3 капли краски на 1 мл дистиллированной воды. Для получения хорошей окраски рекомендуется предварительно проверить на нейтральность воду, в которой будет разведена краска. Проверка нейтральности воды проводится с помощью реакции с гематоксилином. Для этого 5 мл дистиллированной воды налить в чистый стаканчик, сполоснутый этой же водой. Опустить в него несколько крупинок гематоксилина и взболтать воду. Если вода примет красновато-фиолетовый оттенок раньше чем за 1 мин, значит она щелочная. Если же через 5 мин вода останется неокрашенной или приобретет слегка желтоватый оттенок, то она кислая.

Нейтральная вода становится розоватой в промежуток времени между 1 и 5-й мин. Кислую дистиллированную воду нейтрализуют добавлением к ней по каплям 1%-ного раствора углекислого натрия. Щелочную воду нейтрализуют
1%-ным раствором уксусной кислоты. После каждого добавления нейтрализующих растворов необходимо испытывать воду при помощи реакции с гематоксилином.

2. Подсчет количественных соотношений лейкоцитов

Мазки крови поместить на столик микроскопа мазком вверх. Лейкоциты юных видов неравномерно располагаются на поверхности мазка: гранулоциты – по краям, лимфоциты – дальше от края. Подсчет лейкоцитов провести в краевых частях мазка, вдоль длинных сторон препарата. Подсчитать лейкоциты в четырех краевых участках (два из них в начальной части мазка, два других – ближе к концу). В каждом участке исследовать несколько полей зрения, переместить подвижный столик микроскопа зигзагообразно. Установить форму каждого лейкоцита и записать результаты в заранее заготовленную таблицу гемограммы. Сосчитать и определить не менее 100 из общего количества лейкоцитов. После этого высчитать процентное отношение лейкоцитов отдельных форм, т. е. определить лейкоцитарную формулу.

Результаты работы и их оформление. Указать классификацию лейкоцитов по форме ядра и структуре протоплазмы, видовые формы лейкоцитов. Объяснить, как определяется лейкоцитарная формула, каково значение «сдвига влево» лейкоцитарной формулы. Привести примеры лейкоцитозов и лейкопении.

нейтрофил эозинофил базофил моноцит лимфоцит

Рис. 2. Основные виды лейкоцитов