7.6. Определение активности глутатион-S-трансферазы

Глутатион-S-трансфераза катализирует множество реакций детоксикации ксенобиотиков, обмена гормонов, токсинов с участием восстановленного глутатиона. Показано, что этот фермент может проявлять и пероксидазную активность.

Принцип метода. Определение активности этого фермента основано на оценке скорости ферментативного образования глутатион-S-2,4-динитробензола в реакции восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4 динитробензолом.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 6,5.

2. 2 мМ раствор восстановленного глутатиона на 0,1 М фосфатном буфере. Готовят в день определения.

3. Абсолютный метанол.

4. 2 мМ раствор 1-хлор-2,4-динитробензола: 10 мг растворяют в 1 мл метанола и добавляют 23 мл 0,1 М фосфатного буфера.

Ход определения. Гемолизат эритроцитов получают разведением эритровзвеси водой в соотношении 1:10. Реакцию проводят в кювете спектрофотометра, в которую добавляют 1,5 мл раствора 2 мМ глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию запускают добавлением 1,5 мл 2 мМ раствора 1-хлор-2,4-динитробензола. В контрольную пробу вносят вместо гемолизата воду. Измерение оптической плотности проводят при λ = 340 нм против воды сразу же после начала реакции и через 3 мин. Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции образующегося продукта 9,6∙10³ М^–1см^–1, степени разведения и времени инкубации. Результаты выражают в мкмолях·в 1 мин на 1 г гемоглобина в гемолизате.

Литература

Медицинские лабораторные технологии: справочник / под ред. А.И. Карпищенко. – СПб: Интермедика, 1999. – Т. 2. – С. 23–24..