7.5. Определение активности глутатионредуктазы эритроцитов

Принцип метода. Активность фермента измеряют по степени окисления НАДФН при длине волны 340 нм. Некоторые авторы считают, что в инкубационную смесь перед внесением окисленного глутатиона и НАДФН необходимо добавлять ФАД, т. к. глутатионредуктаза является флавопротеином и иногда тканевого содержания ФАД оказывается недостаточно для протекания ферментативной реакции. Однако можно анализировать активность фермента и без использования ФАД. Активность глутатионредуктазы, по данным Beutler (1975), составляет 10,40 ± 1,50 МЕ/г Нb при наличии ФАД в инкубационной среде, а в отсутствие – 7,18 ± 1,09 МЕ/г.

Оборудование: центрифуга MPW-340, центрифужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для спектрофотометра.

Реактивы и их приготовление.

1. 1 М трис-HCl буфер с 5 мМ ЭДТА, рН 8,0.

2. 10 мкМ раствор ФАД.

3. 0,033 М раствор окисленного глутатиона, нейтрализованный до рН 7,4.

4. 2 мМ НАДФН. НАДФН должен быть стандартизирован по методике, указанной при описании определения активности СОД с использованием системы с НАДН-ФМС-ТНС.

Ход определения. В контрольную и опытную пробы в спектрофотометрической кювете добавляют по 0,1 мл раствора трис-HCl с ЭДТА (рН 8,0), по 0,02 мл гемолизата эритроцитов в разведении 1:20. Если реакцию проводят с использованием ФАД, то в обе пробы приливают по 0,2 мл ФАД, а также 1,58 мл дистиллированной воды в контрольную пробу и 1,38 мл – в опытную. К пробам без внесения ФАД приливают дистиллированную воду в количестве 1,78 мл в контрольную пробу и 1,58 мл – в опытную. Затем в опытные пробы вносят по 0,2 мл раствора окисленного глутатиона. Реакцию запускают внесением во все пробы по 0,1 мл НАДФН. Оптическую плотность раствора измеряют при длине волны 340 нм на спектрофотометре сразу после добавления супернатанта и через 5 мин после инкубации реакционной смеси против контрольной пробы. Активность глутатионредуктазы (А) рассчитывают по формуле

^,

где ΔЕ = Е₁ – Е₂ – изменение величины оптической плотности реакционной смеси за 5 мин; V_пр – конечный объем пробы (2 мл); q – фактор разведения эритроцитов; ε – молярный коэффициент поглощения НАДФН, равный 6,22×10³ л·моль^–1·см^–1; V_гем – объем добавленного гемолизата (0,1 мл); t – время инкубации реакционной смеси (5 мин).

Активность глутатионредуктазы выражают в мкмолях превращенного НАДФН в 1 мин на 1 мл эритроцитов, либо на 1 г гемоглобина.

Литература

1. Beutler E. Red cell metabolism. – N. Y., London, 1975. – 160 p.

2. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. – СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. – 104 с.