7.4.2. Определение активности глутатионпероксидазы
с использованием глутатионредуктазы
Принцип метода. ГПО катализирует реакцию окисления восстановленного глутатиона за счет гидроперекисей органического и
неорганического происхождения. Для реакции чаще используют гидроперекись
третичного бутила (t-бутил-гидропероксид). Скорость
реакции образования GSSG измеряют с помощью глутатионредуктазной
реакции
GSSG + НАДФН + Н+ → 2GSH + НАДФ.
Окисление НАДФН регистрируется при длине волны 340 нм.
Реактивы и их приготовление.
1.
2.
3. Глутатионредуктаза, 10 ед./мл.
4. 2 мМ НАДФН. Реактив должен быть стандартизирован по методике,
описанной выше в разделе, посвященном определению активности СОД с помощью
НАДН-ФМС-НАДН.
5. 7 мМ раствор t-бутил-гидропероксида,
готовят ежедневно.
Ход определения. В контрольную и опытную пробы
приливают по 0,2 мл трис-НС1 буфера с ЭДТА, рН 8,0, по 0,04 мл 0,1 М раствора
восстановленного глутатиона, 0,2 мл раствора глутатионредуктазы, 0,2 мл 2 мМ
раствора НАДФН, 0,02 мл гемолизата эритроцитов (1:20)
и дистиллированной воды в количестве 1,32 мл. Пробы инкубируют в течение 10 мин
при температуре 37 °С. Затем в опытную пробу приливают
0,02 мл t-бутил-гидроксипероксида. К серии опытных
проб ставят контрольную пробу, в которой отсутствует гемолизат
и t-бутил-гидроксипероксид, их замещают
соответствующим объемом дистиллированной воды. Скорость реакции зависит от количества внесенного в инкубационную смесь t-бутил-гидропероксида. Снижение оптической плотности измеряют при
длине волны 340 нм. Определяют
разницу между опытной и контрольной пробами и рассчитывают активность фермента,
используя коэффициент молярной экстинкции НАДФН, равный 6,22×10–3.
Активность
выражают в мкмолях НАДФН, отнесенных к 1 г
гемоглобина или 1 мл эритроцитарного гемолизата.
Литература
Гаврилова А.В., Хмара Н.Ф. Определение активности глутатион-пероксидазы эритроцитов при насыщающих
концентрациях субстрата // Лаб. дело – 1986. – № 12. – С. 721–724.