7.4. Определение активности глутатионпероксидазы

 

7.4.1. Определение активности глутатионпероксидазы в эритроцитах

с использованием гидроперекиси третичного бутила

 

Принцип метода. ГПО катализирует расщепление гидроперекиси третбутила, используя в качестве субстрата восстановленный глутатион. С помощью реагента Эллмана, т. е. ДТНБ, определяют концентрацию оставшегося после реакции глутатиона. Реактив Эллмана взаимодействует с SH-группами глутатиона, образуя окрашенное соединение – тионитрофенильный анион. Количество последнего прямо пропорционально количеству SH-групп, прореагировавших с реактивом Эллмана. Об активности ГПО судят по уровню израсходованного в результате реакции восстановленного глутатиона.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,05 М фосфатный буфер с 5 мМ ЭДТА, рН 7,4.

2. 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,4.

3. 2 мМ раствор восстановленного глутатиона, приготовленного на 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,4.

4. Гидроперекись третичного бутила разводят 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,4: 9 мл трет-бутила добавляют к 5 мл фосфатного буфера.

5. 75 мМ трис-ЭДТА буфер, рН 8,5.

6. 20 % раствор ТХУ.

7. 10 мМ реагент Эллмана, приготовленный на метаноле.

Ход определения. Готовят 3 пробы: опытную, контрольную и стандартную. Исходно опытная проба содержит 0,3 мл гемолизата эритроцитов (1:100), 0,2 мл фосфатного буфера с ЭДТА (рН 7,4) и 0,1 мл 2 мМ раствора глутатиона восстановленного. В контрольную пробу вносят 0,5 мл фосфатного буфера с ЭДТА и 0,1 мл 2 мМ раствора восстановленного глутатиона. Стандартная проба содержит 0,5 мл фосфатного буфера с ЭДТА (рН 7,4) и 0,1 мл 2 мМ раствора глутатиона. Все три пробы преинкубируют на водяной бане при температуре 37 °С в течение 2–3 мин. Реакцию запускают добавлением по 0,1 мл гидроперекиси третичного бутила в опытную и контрольную пробы. После 5 мин инкубации в термостате при температуре 37 °С реакцию останавливают 20 % раствором ТХУ, внося по 0,1 мл в каждую пробу, и немедленно охлаждают во льду. В контрольную и стандартную пробы добавляют 0,3 мл гемолизата (1:100), перемешивают. Затем пробы центрифугируют при 4000 g в течение 10 мин. Для регистрации оставшегося глутатиона используют реагент Эллмана – 5,5-дитиобис (2-нитробензойную кислоту). К 2,25 мл трис-ЭДТА буфера (рН 8,5) добавляют 0,6 мл супернатанта и 0,025 мл 10 мМ реагента Эллмана, который реагирует с восстановленным глутатионом, образуя окрашенное соединение с максимумом поглощения при длине волны 412 нм.

Подробный ход анализа ферментативной реакции изложен в таблице 9.

 

Таблица 9. Последовательность добавления реактивов при определении активности глутатионпероксидазы

 

Реактивы

Опыт

Контроль

Стандарт

Гемолизат

эритроцитов (1:100)

 

0,03

 

–

 

–

Фосфатный буфер с ЭДТА (рН 7,4)

 

0,20

 

0,50

 

0,50

Глутатион восстановленный, 2 мМ раствор

 

0,10

 

0,10

 

0,10

 

Инкубация на водяной бане при температуре 37 °С

в течение 2–3 мин

Гидроперекись третичного бутила

 

0,10

 

0,10

 

–

 

Инкубация на водяной бане при температуре 37 °С

в течение 5 мин

ТХУ, 20 % раствор

0,10

0,10

0,10

Гемолизат эритроцитов

–

0,30

0,30

 

Охлаждение во льду и центрифугирование в течение 10 мин при 4000 g

Трис-ЭДТА-буфер, (рН 8,5)

2,25

2,25

2,25

Супернатант

0,60

0,60

0,60

Реагент Эллмана, 10 мМ раствор

0,025

0,025

0,025

 

Измеряют каждую пробу против Н2О при длине волны 412 нм.

Расчёт активности осуществляют по следующей формуле:

,

где Ек, Ест, Еоп – экстинкции соответственно контрольной, стандартной и опытной проб; N – фактор конечного разведения эритроцитарной массы.

Активность фермента выражают в ммолях GSH за 1 мин и относят к 1 мл эритроцитарной взвеси или 1 г гемоглобина.

Литература

Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. – СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. – 104 с.

 

7.4.2. Определение активности глутатионпероксидазы с использованием глутатионредуктазы

 

Принцип метода. ГПО катализирует реакцию окисления восстановленного глутатиона за счет гидроперекисей органического и неорганического происхождения. Для реакции чаще используют гидроперекись третичного бутила (t-бутил-гидропероксид). Скорость реакции образования GSSG измеряют с помощью глутатионредуктазной реакции

GSSG + НАДФН + Н+ → 2GSH + НАДФ.

Окисление НАДФН регистрируется при длине волны 340 нм.

Реактивы и их приготовление.

1. 1 М тpис-HCl буфер с 5 мМ ЭДТА, рН 8,0.

2. 0.1 М раствор восстановленного глутатиона.

3. Глутатионредуктаза, 10 ед./мл.

4. 2 мМ НАДФН. Реактив должен быть стандартизирован по методике, описанной выше в разделе, посвященном определению активности СОД с помощью НАДН-ФМС-НАДН.

5. 7 мМ раствор t-бутил-гидропероксида, готовят ежедневно.

Ход определения. В контрольную и опытную пробы приливают по 0,2 мл трис-НС1 буфера с ЭДТА, рН 8,0, по 0,04 мл 0,1 М раствора восстановленного глутатиона, 0,2 мл раствора глутатионредуктазы, 0,2 мл 2 мМ раствора НАДФН, 0,02 мл гемолизата эритроцитов (1:20) и дистиллированной воды в количестве 1,32 мл. Пробы инкубируют в течение 10 мин при температуре 37 °С. Затем в опытную пробу приливают 0,02 мл t-бутил-гидроксипероксида. К серии опытных проб ставят контрольную пробу, в которой отсутствует гемолизат и t-бутил-гидроксипероксид, их замещают соответствующим объемом дистиллированной воды. Скорость реакции зависит от количества внесенного в инкубационную смесь t-бутил-гидропероксида. Снижение оптической плотности измеряют при длине волны 340 нм. Определяют разницу между опытной и контрольной пробами и рассчитывают активность фермента, используя коэффициент молярной экстинкции НАДФН, равный 6,22×10–3.

Активность выражают в мкмолях НАДФН, отнесенных к 1 г гемоглобина или 1 мл эритроцитарного гемолизата.

 

Литература

Гаврилова А.В., Хмара Н.Ф. Определение активности глутатион-пероксидазы эритроцитов при насыщающих концентрациях субстрата // Лаб. дело – 1986. – № 12. – С. 721–724.