7.3. Определение активности каталазы

 

7.3.1. Определение активности каталазы в крови

 

Принцип метода. Об активности фермента судят по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации. Концентрацию перекиси водорода определяют по реакции с молибдатом аммония, который дает стойкий окрашенный комплекс.

Оборудование. Центрифуга с охлаждением, магнитная мешалка, термостат.

Реактивы и их приготовление. Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

1. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

2. 4 %-ный раствор молибдата аммония (х. ч.). В воде в мерной колбе на 100 мл при нагревании растворяют 4 г молибдата аммония. При комнатной температуре раствор устойчив в течение нескольких недель.

3. 0,1 н. раствор перманганата калия. Готовится из фиксанала.

4. 10 %-ный раствор серной кислоты. 5,99 мл 91,6 %-ной кислоты (плотность 1,822 г/мл) разбавляют до 100 мл водой.

5. Реактивы для определения гемоглобина аммиачным методом.

6. 0,034 %-ный раствор перекиси водорода. Готовят из пергидроля. По мере хранения концентрация пергидроля снижается. Точную концентрацию перекиси водорода определяют титрованием перманганатом калия.

Порядок титрования. Зная приблизительно концентрацию пергидроля (25–30 %), готовят 1 %-ный раствор перекиси водорода. Для чего 1 мл исходной перекиси водорода доводят водой до 25 мл. Берут 1 мл разбавленной (1 %) перекиси водорода, добавляют 9 мл воды и 5 мл 10 %-ной серной кислоты. Титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до слабо розового окрашивания.

Примерный пересчет. Допустим, на титрование ушло 5,8 мл перманганата калия. Вычисляют, сколько г-экв перманганата калия содержалось в 5,8 мл и участвовало в реакции:

1 000 мл – 0,1 г-экв

5,8 мл – х г-экв

х = 0,00058.

При титровании 1 г-экв вещества взаимодействует с 1 г-экв другого вещества. Значит, в реакции участвовало также 0,00058 г-экв перекиси водорода. Эквивалентная масса Н2О2 равна 17,01 г. Следовательно, анализируемый раствор содержит: 0,00058·17,01 = 0,00987 г Н2О2.

Учитывая разведение, концентрация перекиси водорода в 1 мл пергидроля будет: 0,00987·25 = 0,2468 г, а концентрация исходного раствора – 24,68 %.

Ход определения. Перед работой полученный 10 %-ный гемолизат разбавляют 25 раз (0,1 мл гемолизата + 2,4 мл воды) и используют в качестве источника фермента.

Инкубационная среда включает 2 мл 0,034 %-ной перекиси водорода и 0,04–0,05 мл 0,1 %-ного гемолизата (объем гемолизата выбирают таким образом, чтобы в пробе содержалось от 20 до 40 мкг гемоглобина). Концентрацию последнего определяют аммиачным методом.

В пробирки разливают по 2 мл перекиси водорода и предварительно инкубируют в течение 5 мин при 25 °С. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 мл гемолизата. В контрольную пробу вместо ферментативного препарата вносят такое же количество воды. Пробы инкубируют в течение 2 мин при 25 °С. По истечении времени реакцию останавливают добавлением 1 мл 4 %-ного раствора молибдата аммония.

Оптическую плотность проб измеряют при длине волны 410 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм против воды. Об активности каталазы судят по степени уменьшения оптической плотности в опытных пробах (Ео) по сравнению с контрольной (Ек): DЕ = Ек – Ео.

Активность фермента (Акат, мкмоль Н2О2/мг Hb/мин) рассчитывают по формуле

,

где 34 – молекулярная масса перекиси водорода; t – время протекания реакции, мин; с – концентрация гемоглобина в пробе, мг; К – коэффициент перевода значений оптической плотности в мг перекиси водорода (рассчитывают по калибровочному графику).

Построение калибровочной кривой. Предварительно готовят 0,1 %-ный раствор перекиси водорода. Затем разбавляют его водой, как указано ниже (табл. 8).

 

Таблица 8. Схема приготовления стандартных растворов перекиси водорода

 

№ пробирки

0,1  %-ный

раствор перекиси водорода, мл

Дистиллированная вода, мл

Концентрация перекиси водорода в 5 мл раствора, мг

1

0,25

4,75

0,25

2

0,5

4,50

0,5

3

1,0

4,0

1,0

4

1,5

3,5

1,5

5

2,0

3,0

2,0

6

2,5

2,5

2,5

 

Из каждой пробирки (№ 1–6) отбирают по 2 мл разбавленного раствора перекиси водорода и переносят в сухие пробирки (№ 1–6). При этом содержание перекиси водорода в пробирках будет: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мг. Затем в каждую пробирку вносят 1 мл 4 %-ного раствора молибдата аммония. Пробы инкубируют при 24 °С 10 мин, а затем оптическую плотность измеряют при длине волны 410 нм против воды. По полученным данным строят калибровочную кривую, которую используют в дальнейшем для расчета активности каталазы.

 

Литература

Королюк М.А., Иванова Л.Н., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. – 1988. – № 1. – С. 16–19.

 

7.3.2. Определение активности каталазы в мозге

 

Принцип метода. Смотри методику определения активности каталазы в крови.

Отбор проб и их хранение. Крыс забивают декапитацией. Вскрывают череп, быстро извлекают головной мозг и переносят в ледяной раствор 0,9 %-ного хлорида натрия. Через 1–2 мин мозг обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от сосудистой оболочки и на холоде отделяют кору больших полушарий головного мозга. Из коры больших полушарий в стеклянном гомогенизаторе готовят 10 %-ный (1 г мозга + 9 мл среды) гомогенат на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия. Полученный гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин (850 g) в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и заново центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин. Супернатант сливают в охлажденные пробирки и используют в качестве источника фермента.

Оборудование. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением, центрифуга на 20 000 об./мин с охлаждением, стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком, термостат, колориметр.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

2. 4 %-ный водный раствор молибдата аммония.

3. 0,02 %-ный раствор перекиси водорода.

4. Реактивы для определения белка по методу Лоури.

Ход определения. Инкубационная среда для определения активности фермента включает 0,1 мл исследуемого материала и 2 мл 0,02 %-ной перекиси водорода.

В пробирки разливают по 2 мл перекиси водорода, предварительно прогревают их до 25 °С. Затем в каждую пробирку вносят по 0,1 мл супернатанта. В контрольную пробирку вместо ферментативного препарата вносят 0,1 мл бидистиллированной воды. Пробы инкубируют в течение 10 мин при 25 °С. По истечении времени реакцию останавливают добавлением 1 мл 4 %-ного раствора молибдата аммония. Оптическую плотность проб измеряют при длине волны 410 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм против воды.

Об активности каталазы судят по степени уменьшения оптической плотности в опытных пробах (Ео), по сравнению с контрольной (Ек): DЕ = Ек – Ео.

Активность фермента (мкмоль Н2О2/мг белка/мин) рассчитывают по формуле

,

где К – коэффициент пересчета единиц оптической плотности в мг перекиси водорода, рассчитывают по калибровочному графику; М – молекулярная масса перекиси водорода; t – время реакции, мин; С – содержание белка в пробе, мг.

 

7.3.3. Спектрофотометрический метод определения активности каталазы в эритроцитах

 

Каталаза расщепляет перекись водорода, об активности фермента судят по убыли перекиси водорода в инкубационной среде.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,05 М трис-HCl буфер, рН 7,4.

2. 10 мМ раствор перекись водорода. Концентрацию перекиси водорода в растворе пергидроля определяют по методике, изложенной выше.

Ход определения. Для определения активности каталазы отмытые эритроциты гемолизируют 0,05 М буфером трис-HCl (рН 7,4) в соотношении 1:10. 0,02 мл гемолизированных эритроцитов смешивают с 4 мл дистиллированной воды (разведение 1:2000), добавляют одну каплю 96 % этилового спирта и оставляют на 4–12 ч.

Инкубационная смесь содержит 0,1 мл 0,05 М буфера трис-HCl (рН 7,4), 0,04 мл гемолизированных эритроцитов (разведение 1:2000), 1,8 мл дистиллированной воды (контроль) и 1,8 мл 10 мМ раствора Н2О2 (опыт). Снижение оптической плотности в результате расщепления перекиси водорода в опытной пробе измеряют против контроля каждые 30 с в течение 3 мин при комнатной температуре при длине волны 230 нм. Скорость реакции линейная в первые 3–4 мин.

При расчёте активности используют средние значения изменения оптической плотности за каждую минуту в течение 3 мин:

А = Еср../ 0,071,

где А – количество ммоль Н2О2, разрушенной в среднем за 1 мин при добавлении в инкубационную смесь 0,04 мл гемолизата эритроцитов (1:2 000); Еср – среднее значение оптической плотности, рассчитанной за одну минуту; 0,071 – коэффициент молярной экстинкции Н2О2.

Об активности каталазы в гемолизате эритроцитов судят по убыли перекиси водорода за 1 мин, выражают в ммоль Н2О2/мин и относят к 1 мл эритроцитарной взвеси или 1 г гемоглобина.

 

Литература

Leff J.A., Oppengard M.A., Curiel T.J. et al. Progressive increases in serum catalase activity in advancing human immunodeficiency virus infection // Free Rad. Biol. Med. – 1992. – V. 13, № 2. – P. 143–149.