7.2.2. Определение
активности супероксиддисмутазы в мозге
Отбор проб и их хранение. Крыс забивают
декапитацией. Извлекают головной мозг и на холоде отделяют кору больших
полушарий. Из мозга готовят 10 %-ный (
Оборудование. Центрифуга с охлаждением,
гомогенизатор с тефлоновым пестиком, магнитная мешалка, термостат, колориметр
КФК-3.
Реактивы и их приготовление (см. методику
определения активности СОД в эритроцитах).
Ход определения. Для частичной
очистки СОД и осаждения балластных белков к 1 мл полученного супернатанта добавляют 0,25 мл 96 %-ного
этанола и 0,15 мл хлороформа. Смесь перемешивают 15 мин на магнитной мешалке на
холоде. По истечении времени эту смесь на 20 мин оставляют на холоде (0–2°С),
время от времени встряхивая. Пробы перемешивают и центрифугируют при 10000 об./мин в течение 15 мин. Верхний
слой отбирают и используют в качестве источника фермента.
Непосредственно перед определением активности фермента готовят
инкубационную смесь следующего состава: 1 мл 26,9 мкМ
ЭДТА, 1 мл 4,04 мкМ ТНС, 1 мл 65 мкМ
ФМС, 1 мг желатина, 26 мл 0,067 М фосфатного буфера (рН 7,8).
В пробирки
разливают по 2,8 мл инкубационной смеси и выдерживают их 5 мин при 25 °С. Затем в опытные пробы вносят 0,1 мл супернатанта
и 0,1 мл 1 мМ НАДН. В контрольную пробу вместо супернатанта вносят 0,1 мл фосфатного буфера. Инкубацию
проводят в течение 10 мин в термостате при 25 °С в
аэробных условиях в темноте. Реакцию останавливают освещением проб. Оптическую
плотность измеряют при длине волны 540 нм в кювете с
шириной оптического пути 5 мм против смеси, содержащей все компоненты
инкубационной среды, кроме НАДН.
Процесс
ингибирования скорости восстановления ТНС (Т, %) СОД
рассчитывается по формуле
,
где Ек – экстинкция контрольной пробы; Ео – экстинкция опытной пробы.
За условную
единицу активности СОД принимают 50%-ное
ингибирование скорости восстановления ТНС за время инкубации.
Активность
фермента выражают в условных единицах на мг белка:
Аед / мг белка = ,
где С – концентрация белка в пробе, мг.
Литература
1. Дубинина Е.Е., Ефимова Л.Ф., Софронова Л.Н., Геронимус
А.Л. Сравнительный анализ
активности супероксиддисмутазы и каталазы эритроцитов
и цельной крови у новорожденных детей при хронической гипоксии // Лаб. дело. –
1988. – № 8. – С. 16–19.
2. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase // Biochim. – 1975. – V. 57, № 5. – P. 657–660.