7.2.2. Определение активности супероксиддисмутазы в мозге

 

Отбор проб и их хранение. Крыс забивают декапитацией. Извлекают головной мозг и на холоде отделяют кору больших полушарий. Из мозга готовят 10 %-ный (1 г ткани + 9 мл среды) гомогенат на физиологическом растворе. Гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин (800 g) в течение 10 мин. Супернатант повторно центрифугируют при 14000 об./мин (18000 g) в течение 20 мин. Супернатант сливают и хранят на холоде.

Оборудование. Центрифуга с охлаждением, гомогенизатор с тефлоновым пестиком, магнитная мешалка, термостат, колориметр КФК-3.

Реактивы и их приготовление (см. методику определения активности СОД в эритроцитах).

Ход определения. Для частичной очистки СОД и осаждения балластных белков к 1 мл полученного супернатанта добавляют 0,25 мл 96 %-ного этанола и 0,15 мл хлороформа. Смесь перемешивают 15 мин на магнитной мешалке на холоде. По истечении времени эту смесь на 20 мин оставляют на холоде (0–2°С), время от времени встряхивая. Пробы перемешивают и центрифугируют при 10000 об./мин в течение 15 мин. Верхний слой отбирают и используют в качестве источника фермента.

Непосредственно перед определением активности фермента готовят инкубационную смесь следующего состава: 1 мл 26,9 мкМ ЭДТА, 1 мл 4,04 мкМ ТНС, 1 мл 65 мкМ ФМС, 1 мг желатина, 26 мл 0,067 М фосфатного буфера (рН 7,8).

В пробирки разливают по 2,8 мл инкубационной смеси и выдерживают их 5 мин при 25 °С. Затем в опытные пробы вносят 0,1 мл супернатанта и 0,1 мл 1 мМ НАДН. В контрольную пробу вместо супернатанта вносят 0,1 мл фосфатного буфера. Инкубацию проводят в течение 10 мин в термостате при 25 °С в аэробных условиях в темноте. Реакцию останавливают освещением проб. Оптическую плотность измеряют при длине волны 540 нм в кювете с шириной оптического пути 5 мм против смеси, содержащей все компоненты инкубационной среды, кроме НАДН.

Процесс ингибирования скорости восстановления ТНС (Т, %) СОД рассчитывается по формуле

,

где Ек – экстинкция контрольной пробы; Ео – экстинкция опытной пробы.

За условную единицу активности СОД принимают 50%-ное ингибирование скорости восстановления ТНС за время инкубации.

Активность фермента выражают в условных единицах на мг белка:

Аед / мг белка = ,

где С – концентрация белка в пробе, мг.

 

Литература

1. Дубинина Е.Е., Ефимова Л.Ф., Софронова Л.Н., Геронимус А.Л. Сравнительный анализ активности супероксиддисмутазы и каталазы эритроцитов и цельной крови у новорожденных детей при хронической гипоксии // Лаб. дело. – 1988. – № 8. – С. 16–19.

2. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase // Biochim. – 1975. – V. 57, № 5. – P. 657–660.