6.6. Определение содержания сульфгидрильных групп и дисульфидных связей

в белках и низкомолекулярных соединениях

 

Среди функциональных групп биологической системы SH-группам принадлежит важная роль в поддержании структурной целостности и регуляции функциональной активности клеточных компонентов. Их высокая реакционная способность обусловливает активное взаимодействие с различными ацилирующими, алкилирующими, арилирующими и метилирующими веществами, галоидкислотами и их амидами, дисульфидами и карбонильными соединениями, металлами, а также активированными двойными связями, что имеет важное биологическое значение. Так, благодаря этим свойствам тиолы принимают непосредственное участие в регуляции митотического деления клетки, активности ферментных комплексов, катализирующих образование наиболее важных физиологически активных веществ, мышечном сокращении, свертывании крови, проницаемости клеточных и субклеточных мембран, в поддержании структурой целостности и функциональной активности молекулярных компонентов иммунной системы.

SH-соединения как низкомолекулярной, так и белковой природы играют особую роль в функционировании АОС. Проявляя антирадикальное и антиперекисное действие, тиолы подвергаются обратимому (как правило) окислению с образованием соответствующих дисульфидов, поэтому концентрация соединений, содержащих тиоловые (-SH) и дисульфидные (-S-S-) функциональные группы, а также их соотношение (тиолдисульфидный коэффициент SH/SS) могут служить количественной характеристикой состояния неферментативного звена АОС, представленного тиолами.

В белках по реакционной способности различают три типа SH-групп: легко реагирующие, вяло реагирующие и замаскированные. Однако в тканевых экстрактах различными методами выявляются гораздо больше типов SH-групп, и часто им приписывают неодинаковые наименования.

По способу обнаружения методом амперометрического титрования в тканевых экстрактах дифференцируются легкодоступные, свободные, поверхностно расположенные и структурно замаскированные белковые, а также суммарные SH-группы. Легкодоступные SH-группы представляют собой сумму свободных и поверхностно расположенных белковых SH-групп. После осаждения белков в надосадочной жидкости определяются свободные SH группы. Показано, что восстановленный глутатион составляет основную массу свободных SH-групп. По разности между легкодоступными и свободными SH-группами находят количество поверхностно расположенных белковых SH-групп, которые в литературе встречаются под названиями белковые, белковосвязанные SH-группы. Структурно замаскированные белковые SH-группы представляют собой в основном стерически спрятанные и химически связанные SH-группы растворимых белков. В условиях амперометрического титрования они недоступны в таком виде к определению. Естественно, что между различными типами SH-групп не существует резких граней и не всегда легко отнести ту или иную группу к определенному типу. Тем не менее деление SH-групп на типы по реакционной способности полезно и мы в своих исследованиях придерживались указанной классификации.

 

6.6.1. Амперометрический метод определения низкомолекулярных

и белковых сульфгидрильных групп в крови

 

Для определения различных типов SH-групп в крови, белках мембран эритроцитов и синаптосом использовали амперометрический метод титрования. Этот метод является одним из видов электрометрического объемного анализа. В своих исследованиях мы использовали методику, разработанную профессором В.В. Соколовским на аппарате, сконструированном в лаборатории кафедры биохимии Дагестанского государственного университета. Схема установки для амперометрического титрования показана на рис. 14.

 

Описание: Описание: ris9 copy

Рис. 14. Схема установки для амперометрического титрования сульфгидрильных групп: 1 – платиновый электрод; 2 – ячейка с исследуемой пробой; 3 – остеклованный цилиндрик; 4 – магнитная мешалка; 5 – электрический мостик (с нитратом аммония); 6 – ячейка с насыщенным раствором нитрата аммония; 7 – электрический мостик (с хлоридом калия); 8 – миллиамперметр; 9 – электрод сравнения с ртутью; 10 – электролит

 

Принцип метода. При титровании растворов, содержащих тиоловые соединения, азотнокислым серебром ионы серебра связываются с SH-группами с образованием меркаптида по уравнению

R-SH + Ag+ → R-SAg + H+,

где R-SH – соединения, содержащие сульфгидрильные группы; R-SAg – меркаптиды серебра. По достижении конечной точки титрования (когда все SH-группы оказываются блокированными) в растворе появляется избыток ионов серебра. При этом в электрическом элементе, состоящем из погруженных в титруемый раствор платинового индикаторного электрода и электрода сравнения, возникает диффузионный ток, пропорциональный концентрации ионов серебра и измеряемый с помощью миллиамперметра. Содержание SH-групп в исследуемом растворе эквивалентно количеству раствора азотнокислого серебра, затраченного на титрование. Чувствительность метода составляет 0,1–1,0 мкмоль SH-групп.

Данным методом определяются свободные и вяло реагирующие сульфгидрильные группы нативных белков. Замаскированные сульфгидрильные группы белков определяются только после их денатурации.

Оборудование.

1. Милливольтмиллиамперметр М-198/1 с ценой деления 10–8А или вольтамперметр универсальный В7-21А, В7-4Б и др.

2. Платиновый индикаторный электрод. Это стеклянная трубка длиной 100–150 мм, в нижний конец которой впаяна платиновая проволочка так, чтобы снаружи находилась часть проволоки длиной 5–8 мм. Трубку заполняют металлической ртутью, в которую свободно погружен конец проводника (стальная проволока; d = 0,5 мм), связывающего электрод с амперметром.

3. Электрод сравнения. Электродом служит слой ртути, залитый в специальный сосуд (рис. 14). Над ртутью находится раствор электролита (йодид калия и йодид ртути в насыщенном растворе хлорида калия). В раствор электролита опускают проводник, связывающий электрод сравнения с амперметром, и один конец солевого мостика, представляющего собой U-образную стеклянную трубку, заполненную агаровым гелем, приготовленным на насыщенном растворе хлорида калия. Другой конец солевого мостика электрода сравнения опускают в ячейку с насыщенным раствором нитрата аммония. В эту же ячейку опускают вторую U-образную стеклянную трубку с агаровым гелем, приготовленным на насыщенном растворе нитрата аммония. Другой конец этого солевого мостика опускают в ячейку для титрования.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,2 М водный раствор аммиака. 28 мл концентрированного раствора аммиака с плотностью 0,9 г/см3 доводят дистиллированной водой до 1 л.

2. 0,2 М раствор азотнокислого аммония. 16 г азотнокислого аммония растворяют в дистиллированной воде, и объем доводят до 1 л.

3. 0,1 М аммиачный буфер (рН 9,2). Для приготовления буфера 0,2 М раствор аммиака смешивают с 0,2 М раствором азотнокислого аммония в отношении 1:1. В день опыта буфер разводят 10-кратно.

4. Насыщенный раствор хлорида калия. 30 г соли растворяют в дистиллированной воде, и объем доводят до 100 мл.

5. 30 %-ный раствор азотнокислого аммония.

6. Гель для заполнения электрического мостика. При нагревании на водяной бане растворяют 3 г агар-агара в 100 мл насыщенного раствора хлорида калия (азотнокислого аммония).

7. Раствор электролита для электрода сравнения. 4,2 г йодида калия, и 1,3 г йодистой ртути растворяют в насыщенном растворе хлорида калия, и объем доводят до 100 мл. Во избежание подскока напряжения в цепи раствор электролита электрода сравнения следует ежемесячно заменять свежим.

8. Ртуть металлическая. Очистка ртути осуществляется следующим образом: ртуть промывают разбавленной азотной кислотой (разведенной дистиллированной водой в отношении 1:1), затем многократно промывают дистиллированной водой и фильтруют через плотную ткань. Все работы с ртутью производят под тягой в приспособленном для этого помещении.

9. 0,001 н. водный раствор азотнокислого серебра.

10. 1 %-ный раствор додецилсульфата натрия.

11. 6 %-ный раствор сульфосалициловой кислоты.

12. Реактивы для определения белка по Лоури.

13. Растворы для выделения мембран эритроцитов.

Ход определения. Плазма крови. Для определения суммарного (содержания как в белках, так и низкомолекулярных соединениях) количества SH-групп к 0,2 мл плазмы добавляют 1 мл 1 %-ного раствора додецилсульфата натрия и выдерживают 5 мин при 37°С, периодически перемешивая. Затем общий объем пробы доводят аммиачным буфером до 20 мл и титруют.

При определении содержания тиоловых групп низкомолекулярных соединений к 0,5 мл плазмы добавляют 0,7 мл дистиллированной воды и 0,8 мл 6 %-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Через 10 мин белки осаждают центрифугированием при 4000 об./мин в течение 10 мин. Из надосадочной жидкости отбирают 1 мл и к нему добавляют 19 мл аммиачного буфера для титрования.

Гемолизат. К 0,5 мл трижды отмытых эритроцитов добавляют 9,5 мл холодной бидистиллированной воды и оставляют на 10 мин на холоде для гемолиза. Неразрушенные клетки и стромы эритроцитов осаждают при 10000 об./мин в течение 20 мин. Для определения суммарного количества SH-групп из верхнего слоя жидкости (гемолизата) отбирают 0,1 мл и вносят в сосуд для титрования, содержащий 19,9 мл аммиачного буфера.

Для определения количества низкомолекулярных тиоловых соединений к 1 мл гемолизата добавляют 0,8 мл 6 %-ного раствора сульфосалициловой кислоты. После осаждения белков 1 мл надосадочной жидкости используют для титрования.

Как в плазме, так и в гемолизате количество белковых SH-групп рассчитывают по разности между содержанием суммарных SH-групп и SH-групп низкомолекулярных тиоловых соединений.

Мембраны эритроцитов. В белках мембран эритроцитов общее количество свободных SH-групп складывается из поверхностных (легкодоступных) и скрытых (труднодоступных).

При определении суммарного количества SH-групп белков мембран эритроцитов 0,2 мл суспензии мембран солюбилизируют в 1 мл 1 %-ного раствора додецилсульфата натрия (5 мин при 37 °С). Затем общий объем среды аммиачным буфером доводят до 20 мл и титруют.

Измерение количества поверхностных SH-групп мембранных белков проводят в 0,4 мл исходной суспензии.

По разности между содержанием общих и поверхностных SH-групп рассчитывают количество скрытых сульфгидрильных групп белков.

Порядок титрования. Для титрования собирают установку по схеме (рис. 14). В нерабочем состоянии платиновый электрод погружен в стаканчик с дистиллированной водой, конец агарового мостика электрода сравнения погружен в насыщенный раствор азотнокислого аммония.

При анализе в стаканчик с образцом и буфером опускают электрод, агаровый мостик, остеклованный цилиндрик для перемешивания. Включают магнитную мешалку. После того как показание измерительного прибора будет стабильным, начинают титрование, добавляя по 0,05 мл 0,001 н. раствора азотнокислого серебра и отмечая показания прибора.

Для определения результатов титрования строят график, откладывая на оси ординат показания величин тока, а на оси абсцисс – соответствующие им объемы добавленного раствора азотнокислого серебра. Две прямые, соединяющие отмеченные на графике точки, пересекаются в конечной точке титрования – точке эквивалентности (рис. 15).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Рис. 15. Амперометрическое титрование сульфгидрильных групп

 

Содержание SH-групп, эквивалентное количеству затраченного на титрование раствора азотнокислого серебра, вычисляют, исходя из расчета, что 1 мл 0,001 н. раствора азотнокислого серебра эквивалентен 1 мкмолю SH-групп (или 0,033 мг SH-групп).

Содержание сульфгидрильных групп в плазме крови выражают в мкмолях на 100 мл, а в гемолизате – в мкмолях на 100 мл упакованных эритроцитов:

где С – количество SH-групп в мкмолях на 100 мл; VТ – объем 0,001 н. раствора азотнокислого серебра, соответствующий эквивалентной точке; m – разведение пробы; 100 – коэффициент пересчета на 100 мл; Vпр – объем пробы, взятой на титрование.

Количество SH-групп в белках мембран эритроцитов выражают в мкмолях SH-групп на 1 мг белка. Белок определяют по методу Лоури.

 

Литература

1. Соколовский В.В. Амперометрический метод определения низкомолекулярных и белковых сульфгидрильных групп // Вопр. мед. химии. – 1977. – № 3. – С. 15–20.

2. Торчинский Ю.М. Сера в белках. – М., 1977. – 302 с.

 

6.6.2. Количественное определение дисульфидных связей в белках

и низкомолекулярных соединениях крови

 

Принцип метода. Дисульфидные группы восстанавливают сульфитом натрия:

Реакция происходит в присутствии избытка ионов серебра, которые с новыми SH-группами образуют прочную меркаптидную связь, а избыток свободных ионов серебра оттитровывают эквимолярным раствором унитиола.

Отбор проб и их хранение. Плазму крови, гемолизат и мембраны эритроцитов получают по методике определения SH-групп.

Оборудование. Используют то же самое оборудование, что и для титрования SH-групп.

Реактивы и их приготовление. Кроме тех, что используют для титрования SH-групп, необходимы следующие реактивы:

1) 5·10–4 М раствор унитиола. 0,21 мл 5 %-ного раствора ампулированного препарата разбавляют дистиллированной водой до 100 мл (готовят ежедневно);

2) сульфит натрия, кристаллический порошок.

Ход определения. В ячейку для титрования, содержащую 19 мл 0,01 М аммиачного буфера (рН 9,2), последовательно вносят 0,5 мл 10–3 М раствора азотнокислого серебра, 0,25 мл плазмы крови (0,1 мл 10 %-ного гемолизата; 0,2 мл суспензии мембран эритроцитов, содержащей 3–4 мг белка на мл) и 2–3 мг сульфита натрия. Смесь постоянно перемешивают на магнитной мешалке с заданной скоростью. Обратное титрование проводят 5·10–4 М раствором унитиола, добавляя его по 0,05 мл, после того, как показание регистрирующего прибора будет стабильным. По точке эквивалентности вычисляют суммарное количество тиоловых групп (свободные SH-группы + SH-группы, образующиеся после восстановления дисульфидных связей).

При определении количества свободных SH-групп титрование биоматериала производят в тех же условиях, но в отсутствие сульфита натрия. Содержание тиоловых групп выражают в мкмолях на 100 мл плазмы или упакованных эритроцитов (в случае гемолизата), а также на мг белка (в случае мембран эритроцитов), используя следующие выражения:

плазма крови: ,

где С – концентрация тиоловых групп в мкмоль/100 мл плазмы; DV – разность между объемом азотнокислого серебра, содержащегося в пробе (0,5 мл), и объемом унитиола, израсходованного на титрование; 0,25 – количество плазмы, использованное для анализа, мл;

гемолизат:

где m – разведение пробы при приготовлении гемолизата; 0,1 – количество гемолизата, использованное для анализа, мл;

мембраны эритроцитов:

,

где К – количество белка в пробе для анализа, мг.

Содержание дисульфидных связей рассчитывают по разности между количеством SH-групп, обнаруженных в присутствии и отсутствие сульфита натрия.

 

Литература

Соколовский В.В., Белазерова Л.А., Огурцова Р.Е. Метод количественного определения дисульфидных групп крови обратным амперометрическим титрованием // Лаб. дело. – 1977. – № 1. – С. 26–28.