6.4. Определение антиокислительной активности

6.4.1. Определение антиокислительной активности гидрофильных компонентов плазмы крови

Принцип метода. Метод основан на регистрации скорости окисления восстановленной формы 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФИФ) кислородом, растворенным в реакционной среде при наличии и отсутствии биологического материала. При этом бесцветная лейкоформа 2,6-ДХФИФ переходит в окрашенную форму, имеющую максимум поглощения при 600 нм. Константа ингибирования биологическим материалом окисления 2,6-ДХФИФ служит показателем антиокислительной активности биологического материала. Выбор данного субстрата обусловлен тем, что его окислительно-восстановительный потенциал (0,22 В при pH 7,9) позволяет быстро и количественно переводить его из окисленной формы в восстановленную в присутствии сульфата двухвалентного железа. Кроме того, 2,6-ДХФИФ способен окисляться кислородом воздуха с удобной для регистрации скоростью в стационарных условиях.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,25 М фосфатный буфер, рН 7,4. 7,8 г NaH₂PO₄×2H₂O растворяют в 100 мл дистиллированной воды и 11,4 г К₂НРO₄×3Н₂O – в 100 мл дистиллированной воды. К 81 мл второго раствора приливают 19 мл первого раствора и устанавливают нужное значение рН с помощью рН-метра. Затем раствор доводят до 200 мл дистиллированной водой.

2. 0,8 мМ водный раствор 2,6-ДХФИФ в окисленной форме. Для этого 11,6 мг 2,6-дихлорфенолиндофенола растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед анализами.

3. 3,2 мМ раствор закисного сернокислого железа. 44,5 г FeSO₄×7Н₂O растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор готовят непосредственно перед анализами.

Оборудование. Cпектрофотометр с термостатируемой кюветой или спектрофотометр «Спекол» с термостатируемой кюветой; ультратермостат; баня водяная; весы аналитические; колбы мерные; пипетки измерительные; микропипетки на 10 и 20 мкл.

Ход определения. В термостатируемую кювету последовательно добавляют 0,5 мл фосфатного буфера (рН 7,4), 0,15 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, 0,15 мл раствора закисного сернокислого железа и быстро перемешивают. Все растворы должны иметь температуру 37 ºС. Сразу после перемешивания быстро добавляют 10 или 20 мкл плазмы крови (опыт) или воды (контроль), перемешивают и через каждые 30 с после добавления плазмы или воды на протяжении 5 мин измеряют оптическую плотность при 600 нм против воды (D_on, D_к).

Определяют оптическую плотность при 600 нм инкубационной среды, в которой 2,6-ДХФИФ окислен полностью. Для этого в кювету добавляют те же компоненты, но вместо раствора FеSO₄ и пробы добавляют равные им объемы дистиллированной воды (D_max).

Расчет результатов начинают с определения констант скоростей окисления 2,6-ДХФИФ в контроле (К_к) и опыте (К_оп) по формулам:

и ,

где ln – логарифм натуральный (положительный).

Рассчитывают константу ингибирования (К_и) плазмой крови окисления 2,6-ДХФИФ, являющуюся показателем ее антиокислительной активности по формуле

,

где К_и – антиокислительная активность плазмы крови, мл·мин^–1; К_к – константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в контроле; К_оп – константа скорости окисления 2,6-ДХФИФ в опыте; С – концентрация плазмы в инкубационной смеси, мг/л.

Примечания: 1) плазма крови должна быть без гемолиза; 2) исследование должно проводиться не позднее 6 ч после взятия крови.