Глава 6. Методы определения антиокислительной активности

6.1. Общая характеристика системы антиоксидантной защиты организма

Образование АФК и окислительная модификация важнейших биомолекул свойственно нормально метаболизирующей клетке. Окисление идет со значительной скоростью, но стационарная концентрация продуктов пероксидации довольно мала вследствие наличия сложной системы взаимодействующих путей ее регуляции.

Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, на прооксиданты (усиливают свободнорадикальные процессы) и антиоксиданты (тормозят свободнорадикальные процессы). К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы металлов переменной валентности (железо, медь).

Под действием тех или иных агентов скорость ПОЛ может изменяться, однако системы, регулирующие ПОЛ, обладают способностью быстро возвращать уровень ПОЛ к норме. Организм обладает многоуровневой стратегией защиты от повреждающего действия АФК. Защита осуществляется двумя принципиально различными механизмами:

1) снижением образования первой АФК – О₂ путем уменьшения О₂ в клетке или его более быстрого использования дыхательной цепью ввиду снятия ее контроля ∆µН⁺;

2) функционированием специальной АОС, выработанной в процессе эволюции аэробных организмов. Основными функциями этой системы являются: ограничение интенсивности реакций свободнорадикального и перекисного окисления; защита чувствительных к окислительным повреждениям биомолекул мембран, внутри- и внеклеточных структур от действия свободных радикалов и перекисных соединений; восстановление окислительных молекулярных повреждений.

Существуют различные классификации компонентов антиоксидантной системы. Так, по механизмам действий в АОС выделяют антирадикальную (первичную) и антиперекисную (вторичную) защиту. По молекулярному строению среди антиоксидантов выделяют ферменты и неферментные соединения, которые, в свою очередь, могут быть высоко- и низкомолекулярными. Часть защитных систем клетки локализуется в липидной фазе, а часть – в водной фазе. По отношению к действию в водной или липидной фазе антиоксиданты делят на водо- и жирорастворимые. По локализации действия относительно клеточных структур антиоксиданты разделяют на внутриклеточные, мембранные и эстрацеллюлярные. Кроме того, по происхождению антиоксиданты делят на биооксиданты, природные и синтетические соединения. В табл. 4 приведены наиболее известные антиоксиданты.

Таблица 4. Антиоксиданты в живых системах

Антиоксиданты	Локализация	Функция
Ферменты
Cu, Zn-СОД	Эритроциты, цитоплазма, межмембранное пространство митохондрий	Тушение О2
Mn-СОД	Митохондрии	Тушение О2
Внеклеточная СОД	Плазма крови, стенки сосудов Пероксисомы	Тушение О2
Глутатионпероксидаза	Цитоплазма, митохондрии	Тушение Н2О2 Деградация Н2О2 и перекисей липидов
Глутатионтрансфераза	Клеточные мембраны, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, цитозоль	Деградация перекисей липидов
Глутатионредуктаза	Цитоплазма	Восстанавливает окисленный глутатион
Белки
Ферритин	Цитоплазма	Хелатор Fe^2+
Трансферрин	Внеклеточная среда	Хелатор Fe^2+
Лактоферрин	Внеклеточная среда	Хелатор Fe^2+
Церулоплазмин	Внеклеточная среда	Хелатор Cu^2+, окисление Fe^2+, тушение О2
Альбумин	Внеклеточная среда	Хелатор Cu^2+, тушитель HO^•, LOO^•, HOCl
Низкомолекулярные соединения
Витамин Е	Биомембраны	Тушение HO^•, LOO^•, HOCl и т. п.
Убихинол	Биомембраны	Тушение HO^•, LOO^•, HOCl и т. п.
Каротиноиды	Биомембраны	Тушение HO^•, LOO^•, HOCl, ^1О2
Витамин С	Цитоплазма	Тушение HO^•, О2, регенерирует окисляющиеся токоферол и убихинон
Карнозин	Цитоплазма	Тушение HO^•, О2, нейтрализация гипохлорита
N-ацетилцистеин	Цитоплазма	Неизбирательное тушение АФК
Таурин Глутатион	Цитоплазма Цитоплазма, митохондрии	Нейтрализация гипохлорита Тушение HO^•, О2
Мочевая кислота	Кровь	Предотвращение ПОЛ
Билирубин	Кровь	Предотвращение ПОЛ

В табл. 5 приведены концентрации низкомолекулярных антиоксидантов. Ясно, что они значительно выше, чем АФК. Заметим, что среди низкомолекулярных антиоксидантов важную роль играют пищевые вещества: витамины С и Е и каротины. Такими же свойствами обладают ураты и билирубин, которые ранее считали просто ненужными и даже вредными метаболитами.

Таблица 5. Концентрация антиоксидантов в тканях, М

Вещество	Печень	Плазма
Глутатион	10^–2	10^–5
Аскорбат	2∙10^–3	5∙10^–5
Ретинолы	10^–4	10^–6
Токоферолы	4∙10^–6	2∙10^–5
Ураты		3∙10^–4
Каротины		3∙10^–6
Билирубин		10^–5

Антиоксиданты водной фазы. Непосредственными предшественниками гидроксильного радикала, инициирующего цепное окисление липидов, окислительную модификацию белков и нуклеиновых кислот, служат ионы двухвалентного железа и перекись водорода (или образующийся из нее гипохлорит). По этой причине образование радикала гидроксила и свободнорадикальное окисление биомолекул тормозятся веществами, снижающими концентрацию одного из этих двух соединений. К ним относятся:

1. Фермент супероксиддисмутаза, который снижает концентрацию супероксидных радикалов и тем самым препятствует восстановлению ими ионов трехвалентного железа до двухвалентного. В клетке ионы железа хранятся в трехвалентном состоянии в специальных депо, образованных субъединицами белка ферритина.

2. Ферменты каталаза и глутатионпероксидаза, которые удаляют перекись водорода. Эффективность работы глутатионпероксидазы зависит от концентрации свободного глутатиона, при снижении которой может возрастать концентрация цитотоксических гидроксильных радикалов. Регенерация восстановленного глутатиона (GSH) из окисленного (GSSG) осуществляется за счёт НАДФН; этот процесс катализируется ферментом глутатионредуктазой. Недостаток глутатиона в клетках, например эритроцитах, который может быть обусловлен действием токсических веществ, например, ионами тяжелых металлов или наследственным недостатком глутатионредуктазы, приводит к активации перекисного окисления; это, в частности, наблюдается при некоторых видах гемолитических анемий.

Антиоксиданты, тормозящие развитие цепных реакций в липидной фазе. Цепные реакции «ведут» свободные радикалы липидов (L^• и LOO^•), разветвление цепей происходит при взаимодействии продукта пероксидации – гидроперекиси липидов (LOOH) с ионами Fe²⁺. Все соединения, снижающие концентрацию перечисленных веществ, выполняют функцию антиоксидантов. Сюда относятся:

1. Ферменты фосфолипаза и глутатионпероксидаза, которые разрушают гидроперекиси липидов, предотвращая разветвление цепей окисления липидов в мембранах. При этом действие фосфолипазы заключается в отщеплении от фосфолипидов окисленной жирной кислоты, содержащей гидроперекисную группу (LOOH), а действие глутатионпероксидазы сводится к восстановлению этой группы до спиртовой (рис. 11) с одновременным окислением глутатиона (GSH) до дисульфида (GSSG):

LOOH + 2GSH → LOH + GSSG + H₂O.

2. Ловушки радикалов, которые называют иногда «липидными антиоксидантами». По своей химической природе липидные антиоксиданты – это производные фенола. К ним относится α-токоферол (витамин Е), убихинон (коэнзим Q), тироксин и синтетические соединения, например ионол (бутилированный гидрокситолуол).

Рис. 11. Свободнорадикальная активация процессов перекисного окисления липидов. Радикал Х* атакует ненасыщенные связи жирных кислот, приводя к образованию липидных радикалов (а). Процесс ПОЛ, инициируемый этими радикалами, осуществляется как цепная реакция, которая приводит к накоплению различных липоперекисей (б). Последние вызывают нарушения упаковки мембраны и внедрение в области мембранных дефектов молекул воды и гидрофильных соединений, в т. ч. ионов Са²⁺. Кальций активирует фосфолипазу (Фл), которая расщепляет дефектную молекулу липида. Легче всего окисляются фосфолипиды, содержащие полиненасыщенную арахидоновую кислоту. Высвобождение арахидоновой кислоты позволяет использовать ее для образования биологически активных соединений. В дальнейшем специальный фермент глутатионпероксиидаза (Глу-Пер) обеспечивает репарацию мембраны (Болдырев, 2001)

3. Соединения, связывающие железо. Большинство из них, включая такие природные соединения как дипептид карнозин, не просто связывают железо, но, самое главное, не дают ему возможности проникнуть в липидную фазу мембран, поскольку образующиеся комплексы в силу своей полярности не проникают в гидрофобную зону.

Для детоксикации двухвалентного железа в организме существует, по-видимому, целая система окисления и связывания ионов железа. В плазме крови эта система представлена ферментом церрулоплазмином (феррооксидазой), который окисляет Fe²⁺ до Fe³⁺ кислородом без образования свободных радикалов, и белком трансферрином, который связывает и переносит в кровяном русле ионы трехвалентного железа, которые затем захватываются клетками. В клетках железо может восстанавливаться аскорбиновой кислотой и другими восстановителями, но затем окисляется и депонируется в окисленной форме внутри ферментного белкового комплекса ферритина.