5.6. Определение железо-зависимого образования битирозина и окисления триптофана в белках

Как было отмечено выше, высокой чувствительностью к окислению обладают ароматические остатки аминокислот (фенилаланин, тирозин). При окислении фенилаланина образуются о- и м-тирозины, а тирозина – битирозин и 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА):

Битирозин ДОФА

(3,4-дигидроксифенилаланин)

Поскольку битирозин чаще участвует в образовании связей между белковыми молекулами, чем внутри молекул, это может быть одним из важных факторов агрегации белков под действием АФК.

В случае окисления триптофановых остатков генерация радикальных соединений связана с бензольным (А) – 40 % и пирольным (Б) – 60 % кольцами:

А

Б

У перокси-радикалов, образовавшихся в результате первоначального радикального присоединения О₂ к С-3 положению пирольного кольца, в последующем раскрываются кольца с образованием N-формилкинуренина:

N-формилкинуренин

Удачным маркером окислительного повреждения белков является битирозин, стабильный в присутствии различных протеаз. Дополнительная обработка белков с помощью протеаз позволяет повысить чувствительность метода за счет устранения продуктов их модификации, обладающих сходной флуоресцентной характеристикой. К этим соединениям относятся продукты окисления триптофана (N-формилкинуренин), аддукты ретиноевой кислоты с белками, конъюгация 4-гидроксиноненала с лизиновыми остатками белков.

Е.Е. Дубинина разработала адаптированную методику оценки интенсивности металлкатализируемого окисления белков по степени окисления тирозиновых и триптофановых остатков очищенных белков.

Принцип метода. Окислительная модификация тирозиновых остатков белков сопряжена с образованием битирозина, который обладает характерной голубой флуоресценцией. Окисление триптофановых остатков сопровождается снижением флуоресценции, характерной для триптофана.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,4). 18,2 мл 0,067 М раствора KH₂PO₄ смешивают с 81,8 мл 0,067 М раствора Na₂HPO₄·2H₂O. Проверяют pH на pH-метре.

2. 65 мкМ FeSO₄.

3. 85 мкМ ЭДТА.

4. 0,6 мМ Н₂О₂.

В качестве системы, инициирующей металлкатализируемое окисление белков, используют среду Фентона, состоящую из смеси растворов 65 мкМ FeSO₄ и 85 мкМ ЭДТА в соотношении 1:1 и 0,6 мМ Н₂О₂. Концентрация белка в пробах составляет 0,5 мг/мл.

Ход определения. Контрольная проба содержит: 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера (рН 7,4) и 0,05 мл раствора очищенного белка. Опытная проба содержит: 0,85 мл 0,067 фосфатного буфера (рН 7,4), 0,05 мл раствора белка, 0,05 мл смеси растворов 65 мкМ FeSO₄ и 85 мкМ ЭДТА в соотношении 1:1 и 0,05 мл 0,6 мМ Н₂О₂. Обе пробы инкубируют при 37 °С в течение 1, 2 и 24-х часов. По истечении инкубации интенсивность окислительной модификации белков оценивают по степени образования битирозиновых сшивок и по снижению флуоресценции триптофана. Измерения проводят на спектрофлуориметре под углом 90° по отношению к возбуждающему лучу. Изменения триптофана регистрируют при длине волны возбуждения λ = 295 нм и длине волны испускания λ = 340 нм. Образование битирозина регистрируют при длине волны возбуждения λ = 325 нм и длине волны испускания λ = 415 нм.

Полученные данные можно представить в виде процентов по отношению к контрольным пробам, в которых отсутствуют компоненты системы Фентона.

Литература

Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение. – СПб., 2006. – 400 с.