5.5. Определение окисляемости белков сыворотки и плазмы крови

Принцип метода. Степень спонтанной и медь-инициированной модификации белков плазмы и сыворотки крови после инкубации последних при 37°С в течение 20 часов определяют по уровню карбонильных групп по реакции с 2,4-ДНФГ.

Отбор проб и их хранение. В работе используют сыворотку и плазму крови. При получении плазмы крови в качестве антикоагулянта используют 3,8 % раствор цитрата натрия (1:9). Плазму и сыворотку перед использованием разводят буферно-солевым раствором (1:20).

Оборудование. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением, термостат, спектрофотометр.

Реактивы и их приготовление. Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

1. Буферно-солевой раствор. 150 мМ NaCl, приготовленный на 10 мМ натрий-фосфатном буфере (8,1 мМ NaН₂РО₄, 1,9 мМ Na₂НРО₄), рН 7,4.

2. 200 мкМ раствор CuSO₄·5Н₂О.

3. 20 %-ный раствор ТХУ.

4. 2,5 мМ раствор 2,4-ДНФГ, приготовленный на 2,5 М растворе соляной кислоты.

5. 2,5 М раствор соляной кислоты.

6. 10 М раствор мочевины.

7. Этилацетат.

8. 96 %-ный этиловый спирт.

Ход определения. Исследуют исходный уровень карбонильных групп, а также их накопление в присутствии ионов меди в инкубируемых в течение 20 часов пробах.

1. Определение исходного уровня карбонильных групп. В опытную пробирку вносят 0,2 мл в 20 раз разведенной плазмы (сыворотки) и 1,0 мл 2,5 мМ 2,4-ДНФГ, растворенного в 2,5 М НСl, контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ добавляют 1,0 мл 2,5 М в НСl. Все пробы инкубируют в течение 1 часа при 25 °С в темноте, затем добавляют 1 мл охлажденного 20 % раствора ТХУ.

2. Определение окисляемости белков. К 0,9 мл 20 раз разведенной плазмы (сыворотки) добавляют 0,1 мл 200 мкМ раствора CuSO₄·5Н₂О. Пробы инкубируют при 37 °С в течение 20 ч. По истечении времени из опытных и контрольных образцов отбирают 0,2 мл для определения карбонилов, как описано выше.

Все пробы после добавления ТХУ выдерживают 10 мин на холоде. По истечении времени пробы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок промывают 2 раза смесью этилацетат-этиловый спирт (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Для этого к осадку добавляют 2 мл смеси этанол:этилацетат (1:1). Осадок ресуспендируют и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Затем процедуру повторяют. Промытые осадки белков высушивают либо в сушильном шкафу при 40 °С, либо помещением проб в холодильник на ночь без крышек. Высушенные осадки растворяют в предварительно нагретых 2 мл 10 М раствора мочевины на кипящей водяной бане.

Оптическую плотность проб (E_оп) измеряют на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя жидкости 1 см при длине волны 370 нм против контрольной пробы (Е_к).

Содержание карбонильных групп (нмоль фенилгидразонов/мг белка) рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22000 моль^–1·см^–1 для ДНФГ-производных, по формуле:

,

где DЕ =E_оп – Е_к; V – конечный объем пробы (2 мл); С – содержание белка в пробе, мг; 10⁶ – кофициент пересчета на нмоли.

Для определения концентрации белка в плазме используют биуретовый метод.

Литература

Азизова О.А., Пирязев А.П., Москвина С.Н., Асейчев А.В. Метод определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови // Биомед. химия. – 2007. – Т. 53, вып. 1. – С. 99–106.