5.2. Определение окислительной модификации белков плазмы крови

по уровню карбонильных производных,

регистрируемых с помощью реакции с 2,4-динитрофенилгидразином

Интенсивность МКО белков можно оценивать с использованием различных методов, отражающих изменение гидрофобности белковых молекул, потерю гистидиновых остатков, изменение ультрафиолетового спектра белков. Однако при исследовании смесей белков наиболее информативным является определение карбонильных группировок аминокислотных остатков белков, образующихся в ходе их окислительной деструкции.

Наиболее распространенным является метод определения окислительной модификации белков плазмы по реакции образовавшихся карбонильных производных с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ). Этот метод оценки окислительной модификации белков основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-ДНФГ с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов (рис. 10), которые регистрируют спектрофотометрически.

Принцип метода. В результате окисления белков под действием свободных радикалов кислорода образуются альдегидные и кетонные группировки аминокислотных остатков (карбонильные группы), которые взаимодействуют с 2,4-ДНФГ с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Образующиеся 2,4-динитрофенилгидразоны имеют максимум поглощения около 370 нм.

Оборудование. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением, термостат, спектрофотометр.

Рис. 10. Схема образования карбонилов аминокислотных остатков боковых цепей белков и их взаимодействия

с 2,4-динитрофенилгидразином на примере окисления аргинильного остатка (Nyström, 2005)

Реактивы и их приготовление. Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

1. 0,067 М раствор KH₂PO₄. В мерной колбе на 100 мл в воде растворяют 0,907 г KH₂PO₄.

2. 0,067 М раствор Na₂HPO₄·2H₂O. В мерной колбе емкостью 100 мл в воде растворяют 11,866 г Na₂HPO₄·2H₂O.

3. 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,4). 18,2 мл 0,067 М раствора KH₂PO₄ смешивают с 81,8 мл 0,067 М раствора Na₂HPO₄·2H₂O. Проверяют pH на pH-метре.

4. 1 мМ раствор сульфата железа (II). 5,6 мг сульфата железа растворяют в 10 мл воды. Готовят перед опытом.

5. 1 мМ раствор ЭДТА. 6,4 мг ЭДТА растворяют в 10 мл воды.

6. 0,1 мМ раствор перекиси водорода. Готовят после установления исходной концентрации перекиси водорода путем титрования.

7. 20 %-ный раствор ТХУ.

8. 10 мМ раствор 2,4-ДНФГ. 200 мг 2,4-ДНФГ растворяют при нагревании на водяной бане в 100 мл 2 н. соляной кислоты. Раствор хранят в темной склянке при комнатной температуре в течение 1 месяца.

9. 2 н. раствор соляной кислоты. Готовят из фиксанала.

10. 8 М раствор мочевины. В мерной колбе на 50 мл растворяют в воде 24 г мочевины.

11. Этилацетат.

12. 96 %-ный этиловый спирт.

13. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Ход определения. Исследуют исходный уровень окисления белков, а также интенсивность этого процесса в инкубируемых пробах в отсутствие прооксидантов (спонтанный процесс) и в присутствии Fe²⁺– H₂O₂.

1. Определение исходного уровня окисления белков. В опытную пробирку вносят 0,05 мл неразведенной плазмы, 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера (pH 7,4), 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1,0 мл 20 %-ного раствора ТХУ. Контрольная проба содержит все указанные компоненты, но вместо 2,4-ДНФГ вносят такое же количество 2 н. соляной кислоты.

2. Определение уровня спонтанного окисления белков. В опытную и контрольную пробирки вносят 0,05 мл в 6 раз разведенной физраствором плазмы, 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера (pH 7,4). Пробы инкубируют 15 мин при 37 °С. По истечении времени в опытную пробу добавляют 1,0 мл 10 мМ раствора 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ вносят такой же объем 2 н. соляной кислоты.

3. Определение уровня Fe-зависимого окисления белков. В опытную и контрольную пробирки вносят 0,75 мл 0,067 М фосфатного буфера (pH 7,4), 0,05 мл 6 раз разведенной плазмы, 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ сульфата железа (1:1, готовят перед опытом) и 0,1 мл 0,1 мМ H₂O₂. Пробы инкубируют 15 мин при 37 °С. Затем в опытную пробирку добавляют 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1,0 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ вносят такой же объем 2 н. соляной кислоты.

Все пробы после добавления ТХУ оставляют на 1 ч при комнатной температуре, периодически перемешивая. По истечении времени пробы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок промывают 2 раза 4 мл смеси этилацетат – этиловый спирт (1:1). Промытые осадки белков высушивают либо в сушильном шкафу при 40 °С, либо помещением проб в холодильник на ночь без крышек. Высушенные осадки растворяют в 8 М растворе мочевины. Для чего к осадкам добавляют 3 мл 8 М раствора мочевины и по 1 капле 2 н. соляной кислоты. Пробы перемешивают и оставляют на 30 мин. Оптическую плотность пробы (E_on) измеряют на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя жидкости 1 см при длине волны 370  м против контрольной пробы (Е_к).

Содержание карбонильных групп (нмоль фенилгидразонов/мг белка) рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22000 моль^–1·см^–1 для ДНФГ-производных, по формуле:

,

где DЕ =E_оп – Е_к; V – конечный объем пробы (3 мл); С – содержание белка в пробе, мг; 10⁶ – кофициент пересчета на нмоли.