Глава 5. Методы определения продуктов окислительной модификации белков

 

5.1. Механизмы окислительной модификации белков

 

Белки в силу особенностей своего строения являются одними из основных ловушек АФК, которые образуются в процессе действия ионизирующей радиации, фотохимических воздействий, металл-зависимого окисления или как продукт ряда окислительно-восстановительных реакций ферментативной и неферментативной природы.

В связи с разнообразием химического строения, особенностями структурной организации белков процесс окислительной модификации белков носит сложный и специфический характер, что сопряжено с образованием большого количества окисленных продуктов радикальной и нерадикальной природы. Окислительное повреждение белков может быть связано с первичным нарушением или самого скелета полипептидной цепи, или отдельных аминокислотных остатков. Разделить эти процессы можно сугубо условно, т. к. окисление полипептидной цепи влечет за собой окисление остатков аминокислот, и наоборот, окислительная модификация радикалов отдельных аминокислот может сопровождаться либо агрегацией, либо фрагментацией белков. Наиболее чувствительными к окислению являются серосодержащие (метионин, цистеин) и ароматические (гистидин, триптофан, тирозин и фенилаланин) аминокислотные остатки белков. Однако селективное повреждение этих лабильных аминокислотных остатков и механизм их окисления зависят от природы АФК.

Окислительные повреждения белков приводят к образованию нескольких типов радикалов аминокислот и самого полипептидного скелета белка. К ним относятся: 1) углеродные радикалы, локализованные в глубине белковой молекулы (carbon-centered); 2) перокси-радикалы; 3) алкокси-радикалы; 4) тиильные радикалы; 5) азотистые радикалы (nitrogen-centered); 6) ароматические радикалы аминокислотных остатков (ring-derivated).

Образование углеродных радикалов, локализованных в глубине белковой молекулы. Углеродные радикалы в основном образуются при отщеплении водорода от углеродного атома в α положении полипептидной цепи при участи HO• (рис. 6).

Рис. 6. Окислительная деструкция белков

 

Источником HO• могут быть либо ионизирующая радиация, либо металл-катализируемое расщепление Н2О2.

Образовавшийся карбонильный радикал быстро реагирует с О2 с образованием алкилперекиси – радикального промежуточного соединения: R• + O2 → ROO•.

Пероксильный радикал может образоваться и в отсутствие кислорода из гидропероксидов за счет металл-ион-катализируемых реакций.

ROOH + Fe3+ → ROO• + Fe2+ + H+.

Пероксильный радикал может дать алкилпероксид. Их образование происходит путем одноэлектронного восстановления:

ROO• + R’-H → ROOH + R’•

ROO• + e– → ROO– + H+ → ROOH.

Из алкилпероксидов путем одноэлектронного восстановления образуются алкоксирадикалы:

ROOH + e– → RO• + HO–.

Однако алкокси-радикалы в основном образуются из перокси-радикалов:

2ROO• → ROO-OOR (диалкилпероксид)

ROO-OOR→ 2RO• + О2.

Считают, что алкокси-радикалы полипептидных цепей образуются в основном или в результате кросс-терминальных реакций перокси-радикалов, или при распаде гидропероксидсодержащей цепочки за счет быстрой β-фрагментации, что приводит к образованию карбонильных группировок или ацил-радикалов:

~C(O)-NH-C(O•)(R)-C(O)-NHR~ → ~C(O)-NH-C(R)=O + •C(O)-NHR~.

Алкокси-радикал может превращаться и в гидроксил-производное белка.

Образовавшиеся алкил-, алкилперекиси- и алкокси-радикальные продукты тем же путем могут вступать в реакции с другими аминокислотными остатками тех же белков или других белковых молекул, участвуя в образовании новых углерод-радикальных центров.

В отсутствие О2 реакция окисления белка обрывается на стадии образования углеродного центра, который может реагировать с другими радикальными центрами с образованием белок-белковых сшивок R1CCR2. Это приводит к образованию высокомолекулярных агрегатов белков. Агрегация белковых молекул связана с образованием S-S мостиков между цистеиновыми остатками и 2,2’-бифенильных сшивок тирозиновых остатков белков. Ковалентные связи могут образоваться между радикальными центрами одних и тех же аминокислотных остатков и между разными аминокислотными остатками 2-х белковых молекул.

 

Рис. 7. Потенциальные механизмы разрыва пептидных связей

в результате образования α-углеродного радикального центра

 

Фрагментация полипептидной цепи происходит на стадии образования алкокси-радикала. Процесс расщепления может идти по пути α-амидации или диамидным путем (рис. 7).

Радикалы (Nitrogen-centred) азота. Реакция HOCl с белками приводит к образованию нестабильных хлораминов (RNHCl) или хлорамидов (R–C(O)–NCl–R). Распад этих соединений может привести к генерации радикалов азота через расщепление N–Cl связи:

RNH2 + HOCl→ H2O + RNHCl →RN•H + Cl–.

Эти радикалы претерпевают различные превращения, что приводит к образованию углеродных радикалов. Реакция белков с HOCl сопровождается разрушением белка.

Тиильные радикалы. Тиил-радикалы (RS•) образуются в результате отщепления водорода от свободной RH-группы:

R + R’SH → RH + R’S•.

Или путем взаимодействия с НО•:

RSH + HO• → RS• + H2O.

Или путем расщепления дисульфидной связи:

RS–SR + hν → 2RS•.

Эта реакция может быть связана с фотоокислением. Возможно также присоединение электрона к дисульфидной группе, что сопровождается ее разрывом с образованием тиильного радикала:

RS – SR + e–  → RS• + RS–.

Тиильный радикал быстро и обратимо может взаимодействовать с кислородом с образованием тиилпероксильного радикала RSOO•, либо вступать в реакцию конъюгации с глутатионом:

RS• + O2 ® RSOO•

RS• + GSH ® (RSSR) + Н+.

При физиологическом значении рН тиильный радикал реагирует, конкурируя с кислородом, с избытком тиолового аниона, что приводит к генерации дисульфидного анион-радикала:

RS• + RS– ® (RSSR).

В дальнейшем, дисульфидный анион-радикал может реагировать с О2, образуя за счет переноса электронов дисульфид и О2:

(RSSR) + O2 ® RSSR + О2.

Тиил-радикалы быстро димеризуются, что приводит к образованию внутри- и межмолекулярных сшивок в белках. Хотя они и уступают по своей реактивности гидроксильному радикалу, однако они могут атаковать белки, отщепляя атом водорода от α-углеродного атома полипептидной цепи:

RS• + –NH–C(R)H–CO– ® RSH + –NH–•C(R)–CO–.

Радикалы кольцевых остатков аминокислот. Генерация такого типа радикалов связана с кольцами гистидиновых, триптофановых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков белков. Образование радикальных соединений наблюдается при взаимодействии HO• с кольцом тирозиновых аминокислотных остатков белка с образованием радикального аддукта (циклогексадиенильного радикла). В условиях кислой или щелочной среды при отщеплении воды возможно образование фенокси-радикала (TyrO•):

 

 

                                TyrO•

 

Образовавшиеся фенокси-радикалы могут димеризоваться с образованием бифенолов (битирозинов), что приводит к образованию белковых сшивок. Процессы агрегации окисленных белков связывают с появлением битирозиновых сшивок, которые образуются за счёт взаимодействия между собой остатков тирозина из разных полипептидных цепей. Механизм образования битирозина включает генерацию тирозильных радикалов, радикальную изомеризацию, протекающую за счёт дирадикальных реакций, и, наконец, енолизацию:

 

Битирозин

 

Битирозин – нормальный продукт посттрансляционных процессов в специфических структурных белках. В условиях окислительного стресса битирозин является одним из маркеров окислительного повреждения белков.

Металл-катализируемое окисление белков. В физиологических условиях и при патологических состояниях разной интенсивности может протекать МКО белков. Окисление аминокислотных остатков происходит в присутствии металлов переменной валентности (железо, медь), кислорода и Н2О2 и затрагивающее ту часть белковой молекулы, которая участвует в связывании металлов.

Серия экспериментальных исследований позволила Стедману и его коллегам сделать вывод, что МКО – это сайт – специфический процесс, в который вовлекаются Н2О2 и Fe2+ в области металл-связывающей поверхности белка. При физиологических условиях, когда концентрация ионов железа, меди и Н2О2 в тканях низкие, окислительное повреждение белков ограничивается модификацией аминокислотных остатков в области металл-связывающей поверхности белка.

Механизм МКО белков обусловлен функционированием специфических электрон-донорных систем. В этих системах должен присутствовать донатор электронов, который участвует в восстановлении О2 в Н2О2 и Fe3+ до Fe2+. Этот процесс может протекать либо по двухэлектронному пути с образованием Н2О2, либо по одноэлектронному пути с генерацией в начале О2 и последующей дисмутацией до Н2О2. Соответственно восстановление металлов, в частности Fe3+ в Fe2+, может проходить непосредственно за счет доноров электронов либо через промежуточное образование радикала О2. Последний взаимодействует с Fe3+, образуя Fe2+ и О2. Ионы железа фиксируются на металл-связывающей поверхности белка. Комплекс Fe2+-белок реагирует с Н2О2 и генерирует in situ радикал HO•, который вызывает окислительную модификацию аминокислотного остатка в области металл-связывающего участка белка (рис. 8). Это приводит к дезаминированию отдельных аминокислотных остатков ферментов, превращению их в карбонилпроизводные, потере белком каталитической активности и увеличению чувствительности к протеолитической деградации.

Рис. 8. Металл-катализируемая окислительная модификация белков

 

Один из возможных механизмов МКО рассмотрен на примере белка, у которого e-аминогруппа остатка лизина участвовала во взаимодействии с ионом Fe2+ с образованием Fe2+-белкового координационного комплекса. Реакция последнего с Н2О2 приводила к образованию HO•, ОНˉ и комплекса Fe3+-белок. Радикал HO• взаимодействовал с СН2-груп­пировкой, связанной с e-аминогруппой остатка лизина, образуя при этом радикал -СН•, который служил донором электронов для координационного комплекса Fe3+-белок с последующей генерацией комплекса Fe2+-белок. Это сопровождалось деструкцией металл-связывающей поверхности белка и диссоциацией Fe2+-белкового комплекса. Одновременно шло превращение аминогруппы лизинового остатка в иминогруппу с последующим ее дезаминированием и образованием карбонильного (альдегидного) производного (рис. 9).

 

Рис. 9. Возможный механизм сайт-специфического металл-катализируемого окисления белков

 

В результате МКО генерируются в основном карбонил-дериваты аминокислот. Показано, что карбонилпроизводные образуются в результате МКО пролиновых, аргининовых, лизиновых и гистидиновых остатков аминокислот, что может служить маркером разрушения белков за счет АФК при различных физиологических и патологических состояниях. Превращение основных аминокислот аргинина, лизина, гистидина в альдегиды и дальнейшее их окисление в карбоксильные группы ведут к снижению изоэлектрической точки белка.

Ароматические аминокислоты в отличие от аргининовых, лизиновых и гистидиновых остатков, реже входят в состав металл-связывающих поверхностей белков, поэтому они реже подвергаются воздействию МКО.

Образование гидропероксидов белков. Процесс протекает под влиянием HO• или О2, или кислорода, и связан с отщеплением Н+ от карбонильной группы аминокислот за счёт HO• и образованием в дальнейшем при взаимодействии с О2или О2 перекисных соединений:

PrH + Ox                          Pr• + reduced Ox

Pr• + O2                              PrOO•

PrOO• + e-                         PrOO–

PrOO- + H+                          PrOOH

PrOO• + PrH                        PrOOH + Pr•,

где PrH – белковая молекула, которая теряет атом водорода в первоначальной реакции с окислителем Ох; Pr• – углеродсодержащий свободный радикал, который должен иметь достаточное время жизни, необходимое для реакций с кислородом.

Пероксильные радикалы вступают в различные реакции, которые приводят к формированию альдегидов и кетонов, спиртов и гидропероксидов. Алифатические аминокислоты боковых цепей (валин, лейцин, изолейцин и пролин) легче образуют гидропероксиды; они могут также формироваться из ароматических колец и других аминокислот в реакциях с оксидантами.

 

Литература

1. Арчаков А.И., Мохосоев И.М. Модификация белков активным кислородом и их распад // Биохимия. – 1989. – Т. 54, вып. 2. – С. 179–186.

2. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение. – СПб., 2006. – 400 с.

3. Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях // Укр. бioxiм. журн. – 2008. – Т. 80, № 6. – C. 5–18.

4. Муравлева Л.Е., Молотов-Лучанский В.Б., Клюев Д.А., Бакенова Р.А., Култанов Б.Ж., Танкибаева Н.А., Койков В.В., Омарова Г.А. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования // Фундаментальные исследования. – 2010. – № 1. – С. 74–78.

5. Davies M.J. The oxidative environment and protein damage // Biochim Biophys Acta. – 2005. – V. 1703, № 2. – P. 93–109.

6. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies M.J. Biochemistry and pathology of radical mediated protein oxidation // Biochem. J. – 1997. – V. 324. – P. 1–18.

7. Gebicki J.M. Protein hydroperoxides as new reactive oxygen species // Redox Report. – 1997. – V. 3, № 2. – P. 99–110.

8. Hawkins C.L., Davies M.J. Generation and propagation of radical reactions on proteins // Biochem. Biophys. Acta. – 2001. – V. 1504. – P. 196–219.

9. Stadtman E.E. Metal-ion catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Rad. Biol. and Med. – 1990. – V. 9. – P. 315–325.