4.3. Определение продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих

с тиобарбитуровой кислотой в сыворотке и плазме крови

Малоновый диальдегид (МДА) является низкомолекулярным соединением с мол. массой 72,07. МДА образуется лишь при окислении жирных кислот 18:3 и 20:4, а также быстро метаболизируется в митохондриях. Кроме того, в живых системах МДА взаимодействует с макромолекулами, содержащими первичные аминогруппы, например, белками, фосфолипидами и нуклеиновыми кислотами. В результате этой реакции образуются поперечные сшивки между макромолекулами, что уменьшает их конформационную подвижность, делает их токсичными, а также наделяет свойствами мутагенов и канцерогенов.

Существует два больших класса аналитических методов определения МДА: прямые методы, в которых анализируется МДА сам по себе, и непрямые методы оценки продуктов реакции МДА с другими соединениями.

Из непрямых методов наиболее распространенным стал метод с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Тест с ТБК очень чувствителен. С его помощью можно улавливать наномолярные концентрации МДА-стандарта. В то же время этот метод оценки МДА имеет ряд недостатков: он неспецифичен, так как ТБК реагирует не только с МДА, но и со многими другими соединениями (ароматическими альдегидами, аминокислотами, дезоксисахарами, сиаловыми кислотами, гликозилированными белками). Возможно, в условиях высокой температуры ТБК реагирует с МДА, образованным из гидроперекисей в ходе реакции.

малоновый диальдегид

Тем не менее, метод определения МДА в тесте с ТБК широко используется для оценки интенсивности процессов ПОЛ. Это связано с тем, что между липидной пероксидацией и МДА существуют количественные взаимосвязи и продукты, образованные при проведении ТБК-теста, свидетельствуют о присутствии и количестве липидных перекисей.

Принцип метода. Исследование интенсивности ПОЛ ведут, определяя один из промежуточных продуктов перекисного окисления – МДА – с помощью ТБК. МДА и ТБК при высокой температуре и кислом значении pH образуют окрашенный триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы ТБК. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.

Оборудование. Водяная баня, центрифуга со скоростью 6000 об./мин, колориметр КФК-3 или спектрофотометр.

Реактивы и их приготовление.

1. 1 %-ный раствор ортофосфорной кислоты (плотность раствора должна соответствовать 1,004 г/мл). 3,4 мл концентрированной кислоты (86,8 % с плотностью 1,705 г/мл) разбавляют дистиллированной водой до 500 мл.

2. 0,6 %-ный водный раствор тиобарбитуровой кислоты. Растворяют при небольшом нагревании.

3. 0,28 %-ный раствор сульфата железа (II). 28 мг сульфата железа растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

4. Бутанол.

Ход определения. К 0,2 мл сыворотки (плазмы) крови приливают 3 мл 1 %-ного раствора фосфорной кислоты, 1 мл 0,6 % ТБК и 0,1 мл раствора сернокислого железа (железо необходимо для полного разрушения липоперекисей), что соответствует 1 мкмоль в пробе. Пробирки ставят в кипящую водную баню на 1 ч. Затем их охлаждают в холодной воде, добавляют 4 мл бутанола. Тщательно перемешивают и центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин. Оптическую плотность верхней бутанольной фазы измеряют при длине волны 515 и 532 нм против бутанола. Расчет содержания продуктов, реагирующих с ТБК, производят с учетом коэффициента молярной экстинкции МДА, равного 1,56·10⁵ моль^–1см^–1:

,

где X – содержание МДА (в мкмоль/л или нмоль/мл); 4 – объем бутанольной фазы; 0,2 – объем сыворотки; DЕ = Е₅₃₂ – Е₅₁₅.

Литература

Андреева Л.И., Кожемякина А.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбиталовой кислотой // Лаб. дело. – 1988. – № 11. – С. 41–43.