Глава 4. Методы определения продуктов перекисного окисления липидов

4.1. Определение первичных продуктов перекисного окисления липидов в крови

Анализ радикальных продуктов свободнорадикального окисления липидов очень труден из-за нестабильности этих соединений. Поэтому широкое распространение получили методы анализа молекулярных продуктов этого процесса. Продукты ПОЛ делят на первичные, вторичные и конечные. Первичными продуктами ПОЛ являются гидроперекиси липидов, при образовании которых в молекуле жирной кислоты формируются сопряженные двойные связи – диеновые конъюгаты (рис. 5).

Рис. 5. Схематическое изображение формирования диеновых конъюгатов

в ходе перекисного окисления липидов

Возможно также образование конъюгированных триенов. Липидные экстракты, содержащие гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот с такими группировками в своей структуре, обладают поглощением в УФ-области спектра: для диеновых конъюгатов при λ = 232 нм и для конъюгированных триенов при λ = 275 нм. Следует отметить, что величина диеновых конъюгатов и конъюгированных триенов зависит от жирнокислотного состава. Степень окисленности липидов можно определить также по соотношению содержания в них продуктов, поглощающих УФ-излучение на разной длине волн, т. е. по отношению 232/215 нм (индекс окисления), где 215 нм – это максимум поглощения неокисленных (насыщенных) липидов.

Принцип метода. Смесью гептан-изопропиловый спирт извлекают липиды крови. Гептан экстрагирует в основном нейтральные липиды, а изопропанол – фосфолипиды. Таким образом, становится возможным определение продуктов липопероксидации в различных классах липидов. В липидных экстрактах каждой фазы измерения производят при 220 нм (в диапазоне 186–225 нм поглощают ультрафиолетовые лучи изолированные двойные связи), 232 нм (поглощение отражает содержание диеновых конъюгатов) и 278 нм (поглощение зависит от содержания кетодиенов и сопряженных триенов).

Оборудование: качалка, центрифуга на 6000 об./мин, спектрофотометр СФ-46.

Реактивы и их приготовление.

1. Гептан.

2. Изопропиловый спирт (2-пропанол).

3. 1 %-ный раствор ЭДТА, приготовленный на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия.

4. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

5. 1 н. соляная кислота.

Ход определения. К 5 мл смеси гептан-изопропанол (1:1 по объему) добавляют 0,5 мл цельной крови и экстрагируют липиды, встряхивая на качалке в течение 15 мин. Затем после центрифугирования проб при 5000 об./мин в течение 10 мин липидные экстракты сливают в мерные пробирки с притертой пробкой и разбавляют 5 мл смеси гептан-изопропанол (3:7 по объему). Последнюю процедуру выполняют с целью достижения оптимальных значений оптической плотности в обеих фазах экстракта. К разбавленным липидным вытяжкам для разделения и отмывки от нелипидных примесей добавляют 2 мл 1 н. соляной кислоты. После интенсивного встряхивания пробы оставляют на 15 мин при 4 °С для разделения фаз.

По истечении времени гептановую фазу отбирают в отдельную сухую пробирку, а к водно-спиртовой фазе добавляют 1 г хлорида натрия для обезвоживания изопропанольного экстракта. Пробы встряхивают и оставляют на 10 мин для разделения фаз. После отделения водной фазы изопропанол переносят в отдельную пробирку. Оптические контроли готовят путем экстракции по схеме, описанной выше, но вместо крови берут 0,5 мл 0,1 % раствора ЭДТА на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия. Измеряют оптическую плотность каждой фазы против соответствующего контроля при 220, 232 и 278 нм. Расчеты содержания продуктов ПОЛ производят, соотнося величины соответствующих экстинкций с 1 мл исследуемой крови, по формуле:

Е/мл крови =

(для гептановой фазы: = Е·8; для изопропанольной фазы: = Е·12).