3.3.1. Определение активности ксантиноксидазы в печени

Принцип метода. Метод определения активности ксантиноксидазы основан на способности фермента при преобразовании ксантина в мочевую кислоту генерировать супероксид-анион радикал, о содержании которого можно судить по скорости восстановления нитросинего тетразолия в окрашенный продукт – формазан, имеющий максимум поглощения при длине волны 540 нм.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,05 М натрий-фосфатный буфер с 1 мМ ЭДТА, рН 7,8.

2. Субстратная смесь: к 100 мл буфера добавляют 680 мкг (50 мкМ) гипоксантина, 460 мкг (15 мкМ) феназинметасульфата, 5,71 мг (420 мкМ) нитросинего тетразолия, 140 мг желатина. Раствор готовят перед исследованием либо хранят в замороженном виде.

Ход определения. 3 мл субстратной смеси прогревают в течение 5 мин в кювете спектрофотометра при температуре 37°С. Реакцию запускают добавлением 100 мкл цитозольной фракции ткани печени, полученной при дифференциальном центрифугировании. Регистрируют скорость увеличения оптической плотности пробы в течение 10 мин при длине волны 540 нм и температуре инкубации 37 °С в кювете с длиной оптического пути 10 мм против инкубационной среды равного объема, куда вместо пробы добавляют дистиллированную воду.

Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции формазана, равного 7,2·10³ М^–1см^–1.