Глава 3. Методы определения активных форм

кислорода и продуцирующих их систем

3.1. Образование NO в организме

NО синтезируется из гуанидинового атома азота L-аргинина семейством цитохром-Р450-подобных гемопротеинов – NО-синтаз (NОS), которые присоединяют молекулярный кислород к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина. NОS в реакции с L-аргинином одновременно с NО продуцируют неактивный конечный продукт – L-цитруллин, который является маркером активности NОS. В области гема происходит связывание L-аргинина и молекулы кислорода и осуществляется основная реакция – окисление L-аргинина с выделением из него молекулы NO в свободной форме. Суммарное уравнение катализируемой NOS реакции включает пятиэлектронное (N^3-→N²⁺) окисление атома азота аргинина, сопряженное с окислением НАДФН:

2L-аргинин + 3НАДФН₂ + 4O₂ + 3H⁺→ 2L-цитруллин + 2NO + 3НАДФ⁺ + 4H₂O

Некоторые характеристики синтазы оксида азота. Ферменты, катализирующие продукцию большей части NO, уникальны по сложности организации, включают рекордное число разнообразных кофакторов: ФМН, ФАД, гем и кальций-кальмодулин и, по крайней мере, 3 субстрата – аргинин, кислород и НАДФН.

В неактивном состоянии NOS представляет собой мономер, содержащий пять мест связывания для 5 разных кофакторов (рис. 3). При наличии в окружающей среде всех кофакторов и аргинина происходит димеризация NOS и фермент становится активным.

В каждом мономере различают несколько дискретных доменов (рис. 3). Начиная с С-конца, различают редуктазный домен, имеющий высокую степень гомологии с цитохром-Р450-редуктазой; небольшой кальмодулинсвязывающий домен; оксигеназный домен, обладающий многими характеристиками цитохром-Р450-редуктазы, но без структурной гомологии с последней; N-концевую последовательность, специфичную для каждой изоформы. Редуктазный домен содержит два флавиновых кольца – одно в виде ФАД, другое – ФМН. ФАД является первичным акцептором электронов от НАДФН, а ФМН переносит электроны от ФАД на гем в оксигеназном домене. Оксигеназный домен содержит участки связывания для гема, Арг и ВН₄. На этом домене происходит окисление аргинина с выделением из него молекулы NO.

Рис. 3. Схематическое представление синтеза NО и регуляции работы NO-синтазы.

ВН₄ – тетрагидробиоптерин; СаМ – кальмодулин

По характеру индукции и действия синтазы оксида азота разделяются на два класса. Первый класс составляют кальций-кальмодулинзависимые, конститутивно экспрессируемые физиологическими факторами NОS. Конститутивные NОS подразделяются на нейрональную (nNOS, тип I) и эндотелиальную (еNОS, тип III) изоформы. Они обеспечивают синтез NO в физиологических условиях. Конститутивные NOS обнаружены во многих клетках органов и тканей. Что касается особенностей локализации, то nNOS, как было установлено, в большом количестве присутствует в нейронах, эндотелиальных клетках, в т. ч. эндотелии эфферентной артериолы почек, в тромбоцитах и др. eNOS локализуется в больших количествах в эндотелии и, в частности, в тромбоцитах, интерлобулярной и афферентной артериолах, эфферентной артериоле, а также в гломерулах, мезангиальных клетках и др. Молекулярная масса субъединиц eNOS составляет 135 кДа, а nNOS – 160 кДа.

Во второй класс синтаз оксида азота входит кальций-независимая, индуцибельно экспрессируемая NОS (iNOS, тип II). Молекулярная масса субъединиц iNOS составляет 130 кДа. iNOS обнаружена в различных клетках органов и тканей. Индуцибельные формы NOS в физиологических условиях неактивны. Синтез их увеличивается в ответ на действие патогенных стимулов. При активации iNOS происходит продолжительное повышение генерации NО.

Основные функциональные различия изоформ заключаются в том, что Са²⁺ необходим для активации eNOS и nNOS, в то время как кальмодулин связан с iNOS столь прочно, что наличие Са²⁺ в среде не является необходимым. Эндотелиальная NOS демонстрирует свою активность только в присутствии кальция и кальмодулина. Увеличение продукции NO происходит пропорционально поступлению в цитоплазму кальция либо извне, либо из эндоплазматического ретикулума (при действии ацетилхолина, брадикинина и других агентов, стимулирующих реакции фосфатидилинозитолфосфатного цикла).

Поступление ионов кальция в цитоплазму нейронов через каналы, возбуждаемые аминокислотами, приводит к активации nNOS, увеличению продукции NO и активации гуанилатциклазы.

Механизмы регуляции активности iNOS. В культуре мезангиальных клеток интерлейкин-1β и вещества, повышающие концентрацию цГМФ, индуцируют экспрессию гена iNOS. Это приводит к повышению активности фермента и образованию NO. К настоящему времени установлено, что кроме интерлейкина-1β синтез iNOS индуцируется интерфероном-γ, фактором некроза опухолей (TNFα), липополисахаридами грамотрицательных бактерий. Пик продукции этой формы NOS достигается по одним источникам через 6 ч, по другим – через 12 ч после начала действия индуктора. К этому времени независимая от кальция продукция NO достигает уровня, при котором начинает сказываться влияние NO не только на гуанилатциклазу, но и на железосодержащие компоненты дыхательной цепи митохондрий, на аконитазу, рибонуклеотидредуктазу. В результате этого в клетках, подвергнутых действию таких количеств NO, нарушается энергетический обмен и синтез ДНК. В организме эта способность оксида азота используется для уничтожения опухолевых клеток макрофагами, которые не только сами производят NO, но и секретируют фактор некроза опухолей, который вызывает индукцию NOS в опухолевых и других клетках.