2.9. Определение белка в плазме крови биуретовым методом

Принцип метода. Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди в щелочной среде.

Реактивы и их приготовление.

1. Стандартный раствор белка, например, сывороточного альбумина, содержащий 10 мг в 1 мл 0,9 % раствора NaCl.

2. Биуретовый реактив: 0,15 г CuSO₄×5H₂О и 0,6 г NаКС₄Н₄О₆×4Н₂О (виннокислый натрий-калий или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О при энергичном перемешивании, приливают туда 30 мл 10 %-ного раствора NаОН (свободного от Nа₂СО₃), добавляют 0,1 г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в парафинированной или полиэтиленовой склянке.

3. 0,9 % раствор NaCl.

Ход определения. К 1 мл разведённой в 10 раз плазмы добавляют 4 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Через 30 мин определяют оптическую плотность проб при длине волны 540 нм в кюветах толщиной 10 мм против контроля. В контрольную пробу вместо исследуемого материала добавляют 1 мл дистиллированной воды. Содержание белка в пробе в мг находят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Калибровочный график строят по стандартному раствору альбумина (10 мг белка в 1 мл), используя следующую схему:

Схема разведения стандартного раствора альбумина

№	Стандартный раствор альбумина, мл	Физраствор, мл	Количество альбумина, мг	Примечание
1	0,2	0,8	2	Во все пробы добавить 4 мл биуретового реактива и через 30 мин колориметрировать при длине волны 540 нм против контрольной пробы.
2	0,4	0,6	4
3	0,6	0,8	6
4	0,8	0,9	8
5	1,0	–	10
Контроль	–	1,0	–

Полученные результаты используют для построения калибровочного графика.

Литература

Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358 с.