2.8. Количественное определение белка методом Лоури

Принцип метода. Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот (триптофан и тирозин) с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Высокая чувствительность метода дает возможность определять 10–100 мкг белка в пробе. Однако по сравнению с методами, основанными на биуретовой реакции, метод Лоури менее специфичен, так как интенсивность окрашивания зависит от аминокислотного состава белка.

Оборудование: фотоколориметр.

Реактивы и их приготовление.

1. 2 %-ный раствор карбоната натрия, приготовленный на 0,1 н. натриевой щелочи.

2. 0,5 %-ный раствор сернокислой меди, приготовленный на 1 %-ном растворе цитрата натрия.

3. Рабочий раствор: 1 мл раствора 2 смешивают с 50 мл раствора 1. Готовится непосредственно перед употреблением.

4. Реактив Фолина – Чикальтеу. В круглодонную колбу на 1 л наливают 350 мл дистиллированной воды. Добавляют 50 г вольфрамата натрия (NaWO₂·2H₂O), 12,5 г молибдата натрия (NaМоO₂·2H₂O) и перемешивают до полного растворения. К полученному раствору приливают 25 мл 85 %-ного раствора фосфорной кислоты, 50 мл концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят с обратным холодильником 10 ч. Затем добавляют 75 г сернокислого лития, 25 мл дистиллированной воды и 3 капли брома. Кипятят, но уже без холодильника, в течение 15 мин под тягой для удаления избытка брома. Охлаждают до комнатной температуры, и дистиллированной водой общий объем доводят до 500 мл. Перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 мл, разводят 10 раз дистиллированной водой и титруют 0,1 н. раствором натриевой щелочи по фенолфталеину. После этого ко всему объему добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить конечную концентрацию кислоты в растворе, равную 1 н. Хранят в темной склянке с притертой пробкой. Может храниться длительное время.

5. 0,1 н. и 1 н. растворы натриевой щелочи.

6. 1 %-ный раствор дезоксихолата натрия.

7. 10 % и 2 %-ный растворы трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

Ход определения. Исследуемый раствор, содержащий до 100 мкг белка, доводят дистиллированной водой до 0,4 мл. (При определении белка в мембранной фракции их предварительно нужно солюбилизировать 1 %-ном раствором дезоксихолата натрия или 0,1 н. раствором натриевой щелочи и рекомендуется доводить объем пробы до 0,4 мл этими детергентами). Смешивают с 2 мл рабочего раствора (3), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина – Чикальтеу. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и через 30 мин колориметрируют при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя жидкости 5 мм. Предварительно строят калибровочный график по стандартному раствору белка. По калибровочному графику определяют содержание белка в опытной пробе.

В случае предварительного осаждения белка к исследуемому раствору добавляют ТХУ из такого расчета, чтобы конечная концентрация ее была 3–5 %. Раствор тщательно перемешивают и оставляют на 10–20 мин. Выпавший осадок белка отделяют центрифугированием (6000 об./мин, 10 мин), а затем промывают 2 %-ным раствором ТХУ. К осадку добавляют 1–2 мл 1 н. раствора натриевой щелочи и осторожно подогревают до растворения осадка белка. Раствор белка переносят в мерную колбу на 25–50 мл, доводят до метки, тщательно перемешивают и проводят определение белка.

Построение калибровочного графика на белок. Готовят стандартный раствор белка. Для этого 10 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в небольшом количестве (2–3 мл) 0,1 н. натриевой щелочи и объем доводят до 50 мл этой же щелочью. В 1 мл этого раствора содержится 200 мкг белка. Состав проб для определения белка в стандартных растворах приведен в табл. 2.

Таблица 2. Схема смешивания реактивов для определения содержания белка по методу Лоури

№ пробирки	Стандартный раствор, мл	Белок, мкг	0,1 н. раствор натриевой щелочи	Примечание
1 2 3 4 5 Контроль	0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 –	10 20 40 60 80 –	0,35 0,3 0,2 0,1 – 0,4	В каждую пробирку добавляют 2 мл рабочего раствора и через 10 мин 0,2 мл реактива Фолина. Пробы выдерживают при комнатной температуре 30–40 мин и фотометрируют при длине волны 750 нм против контрольной пробы

По результатам колориметрирования строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс количество белка в пробирке, а на оси ординат – оптическую плотность.

Литература

Lowry D.H., Rosebrough H.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193, № 1. – P. 265–275.