2.6. Определение гемоглобина в крови аммиачным методом

Принцип метода. В результате гемолиза эритроцитов разведенным раствором аммиака образуется оксигемоглобин, отличающийся сравнительно стойкой окраской. По результатам анализа значений оптической плотности судят о его концентрации.

Отбор проб и их хранение. Кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином (200 ед./мл) и сразу же используют в работе.

Оборудование: центрифуга с охлаждением, фотоколориметр КФК-2, КФК-3 и др.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,04 %-ный раствор аммиака. Его готовят из 25 %-ного концентрированного (плотность – 0,91 г/мл) раствора аммиака, к 1,6 мл которого приливают дистиллированную воду до объема 100 мл.

2. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Ход определения. Кровь центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают плазму, а эритроциты отмывают холодным физиологическим раствором три раза, каждый раз центрифугируя при тех же оборотах в течение 5 мин. Полученные отмытые эритроциты гемолизируют в пробирках на холоде. Для этого к 0,3 мл эритроцитов с помощью пипетки сильной струей приливают 2,7 мл охлажденной бидистиллированной воды. Суспензию периодически встряхивают в течение 5 мин. Затем центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин для осаждения стромы и неразрушенных клеток.

Для определения содержания общего гемоглобина к 4,9 мл 0,04 %-ного раствора аммиака прибавляют 0,1 мл полученного гемолизата. Оптическую плотность раствора измеряют при длине волны 540 нм в кювете на 5 мм. Содержание гемоглобина рассчитывают по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика на гемоглобин. Из крови крыс готовят раствор гемоглобина, используя один из методов, описанных ниже. В ней определяют концентрацию гемоглобина с помощью тест-набора гемиглобинцианидным методом. Затем раствор гемоглобина с точно установленной концентрацией разбавляют водой таким образом, чтобы в 0,1 мл находилось от 1 до 10 мг гемоглобина. К каждой пробе добавляют 4,9 мл 0,04 %-ного раствора аммиака и через 10 мин фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете со слоем жидкости 5 мм. По полученным данным строят график зависимости экстинкции от концентрации гемоглобина.

Приготовление раствора гемоглобина.

Первый метод. Собранную кровь (3–4 мл) центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Плазму и верхний слой эритроцитов удаляют. Эритроциты трижды отмывают 0,9 %-ным раствором хлорида натрия и последующим центрифугированием. К полученной эритроцитарной массе в равном объеме добавляют дистиллированную воду и 0,4 объема четыреххлористого углерода (хлороформ). Пробирку закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10 мин. После этого пробирку оставляют на 1 ч в холодильнике. Затем образец центрифугируют при 10000 об./мин в течение 30 мин, либо при 4000–5000 об./мин в течение 1 ч. Гемолизат осторожно отбирают (под ним остается довольно плотный слой стромы, а внизу – четыреххлористый углерод).

Второй метод. Эритроциты, после удаления плазмы, трижды отмывают 0,9 %-ным раствором хлорида натрия, центрифугируя каждый раз при 3000 об./мин в течение 10 мин. К отмытым эритроцитам добавляют 2 объема дистиллированной воды, и в течение 15–18 ч при 3–4°С проводят гемолиз. Раствор гемоглобина отделяют от стромы эритроцитов центрифугированием при 10000–12000 об./мин в течение 20 мин.

Концентрацию гемоглобина в растворе, полученном как первым, так и вторым методами, устанавливают гемиглобинцианидным методом, используя стандартные наборы.

Литература

Лопатина Н.И., Геронимус А.Л., Тренестова Е.П. Определение фетального гемоглобина в крови при помощи ФЭКа // Лаб. дело. – 1976. – № 6. – С. 328–331.