Глава 5. Методы определения продуктов

окислительной модификации белков

 

5.1. Механизмы окислительной модификации белков

 

Белки в силу особенностей своего строения являются одними из основных ловушек АФК, которые образуются в процессе действия ионизирующей радиации, фотохимических воздействий, металл-зависимого окисления или как продукт ряда окислительно-восстановительных реакций ферментативной и неферментативной природы.

В связи с разнообразием химического строения, особенностями структурной организации белков процесс окислительной модификации белков носит сложный и специфический характер, что сопряжено с образованием большого количества окисленных продуктов радикальной и нерадикальной природы. Окислительное повреждение белков может быть связано с первичным нарушением или самого скелета полипептидной цепи, или отдельных аминокислотных остатков. Разделить эти процессы можно сугубо условно, т. к. окисление полипептидной цепи влечет за собой окисление остатков аминокислот, и наоборот, окислительная модификация радикалов отдельных аминокислот может сопровождаться либо агрегацией, либо фрагментацией белков. Наиболее чувствительными к окислению являются серосодержащие (метионин, цистеин) и ароматические (гистидин, триптофан, тирозин и фенилаланин) аминокислотные остатки белков. Однако селективное повреждение этих лабильных аминокислотных остатков и механизм их окисления зависят от природы АФК.

Окислительные повреждения белков приводят к образованию нескольких типов радикалов аминокислот и самого полипептидного скелета белка. К ним относятся: 1) углеродные радикалы, локализованные в глубине белковой молекулы (carbon-centered); 2) перокси-радикалы; 3) алкокси-радикалы; 4) тиильные радикалы; 5) азотистые радикалы (nitrogen-centered); 6) ароматические радикалы аминокислотных остатков (ring-derivated).

Образование углеродных радикалов, локализованных в глубине белковой молекулы. Углеродные радикалы в основном образуются при отщеплении водорода от углеродного атома в α положении полипептидной цепи при участи HO• (рис. 6).

Рис. 6. Окислительная деструкция белков

 

Источником HO• могут быть либо ионизирующая радиация, либо металл-катализируемое расщепление Н2О2.

Образовавшийся карбонильный радикал быстро реагирует с О2 с образованием алкилперекиси – радикального промежуточного соединения: R• + O2 → ROO•.

Пероксильный радикал может образоваться и в отсутствие кислорода из гидропероксидов за счет металл-ион-катализируемых реакций.

ROOH + Fe3+ → ROO• + Fe2+ + H+.

Пероксильный радикал может дать алкилпероксид. Их образование происходит путем одноэлектронного восстановления:

ROO• + R’-H → ROOH + R’•

ROO• + e– → ROO– + H+ → ROOH.

Из алкилпероксидов путем одноэлектронного восстановления образуются алкоксирадикалы:

ROOH + e– → RO• + HO–.

Однако алкокси-радикалы в основном образуются из перокси-радикалов:

2ROO• → ROO-OOR (диалкилпероксид)

ROO-OOR→ 2RO• + О2.

Считают, что алкокси-радикалы полипептидных цепей образуются в основном или в результате кросс-терминаль­ных реакций перокси-радикалов, или при распаде гидропероксидсодержащей цепочки за счет быстрой β-фрагментации, что приводит к образованию карбонильных группировок или ацил-радикалов:

~C(O)-NH-C(O•)(R)-C(O)-NHR~ → ~C(O)-NH-C(R)=O + •C(O)-NHR~.

Алкокси-радикал может превращаться и в гидроксил-производное белка.

Образовавшиеся алкил-, алкилперекиси- и алкокси-ради­кальные продукты тем же путем могут вступать в реакции с другими аминокислотными остатками тех же белков или других белковых молекул, участвуя в образовании новых углерод-радикальных центров.

В отсутствие О2 реакция окисления белка обрывается на стадии образования углеродного центра, который может реагировать с другими радикальными центрами с образованием белок-белковых сшивок R1CCR2. Это приводит к образованию высокомолекулярных агрегатов белков. Агрегация белковых молекул связана с образованием S-S мостиков между цистеиновыми остатками и 2,2’-бифенильных сшивок тирозиновых остатков белков. Ковалентные связи могут образоваться между радикальными центрами одних и тех же аминокислотных остатков и между разными аминокислотными остатками 2-х белковых молекул.

 

Рис. 7. Потенциальные механизмы разрыва пептидных связей в результате образования α-углеродного радикального центра

 

Фрагментация полипептидной цепи происходит на стадии образования алкокси-радикала. Процесс расщепления может идти по пути α-амидации или диамидным путем (рис. 7).

Радикалы (Nitrogen-centred) азота. Реакция HOCl с белками приводит к образованию нестабильных хлораминов (RNHCl) или хлорамидов (R–C(O)–NCl–R). Распад этих соединений может привести к генерации радикалов азота через расщепление N–Cl связи:

RNH2 + HOCl→ H2O + RNHCl →RN•H + Cl–.

Эти радикалы претерпевают различные превращения, что приводит к образованию углеродных радикалов. Реакция белков с HOCl сопровождается разрушением белка.

Тиильные радикалы. Тиил-радикалы (RS•) образуются в результате отщепления водорода от свободной RH-группы:

R + R’SH → RH + R’S•.

Или путем взаимодействия с НО•:

RSH + HO• → RS• + H2O.

Или путем расщепления дисульфидной связи:

RS–SR + hν → 2RS•.

Эта реакция может быть связана с фотоокислением. Возможно также присоединение электрона к дисульфидной группе, что сопровождается ее разрывом с образованием тиильного радикала:

RS – SR + e–  → RS• + RS–.

Тиильный радикал быстро и обратимо может взаимодействовать с кислородом с образованием тиилпероксильного радикала RSOO•, либо вступать в реакцию конъюгации с глутатионом:

RS• + O2 ® RSOO•

RS• + GSH ® (RSSR) + Н+.

При физиологическом значении рН тиильный радикал реагирует, конкурируя с кислородом, с избытком тиолового аниона, что приводит к генерации дисульфидного анион-радикала:

RS• + RS– ® (RSSR).

В дальнейшем, дисульфидный анион-радикал может реагировать с О2, образуя за счет переноса электронов дисульфид и О2:

(RSSR) + O2 ® RSSR + О2.

Тиил-радикалы быстро димеризуются, что приводит к образованию внутри- и межмолекулярных сшивок в белках. Хотя они и уступают по своей реактивности гидроксильному радикалу, однако они могут атаковать белки, отщепляя атом водорода от α-углеродного атома полипептидной цепи:

RS• + –NH–C(R)H–CO– ® RSH + –NH–•C(R)–CO–.

Радикалы кольцевых остатков аминокислот. Генерация такого типа радикалов связана с кольцами гистидиновых, триптофановых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков белков. Образование радикальных соединений наблюдается при взаимодействии HO• с кольцом тирозиновых аминокислотных остатков белка с образованием радикального аддукта (циклогексадиенильного радикла). В условиях кислой или щелочной среды при отщеплении воды возможно образование фенокси-радикала (TyrO•):

 

 

                                                                                                                                                                      TyrO•

 

Образовавшиеся фенокси-радикалы могут димеризоваться с образованием бифенолов (битирозинов), что приводит к образованию белковых сшивок. Процессы агрегации окисленных белков связывают с появлением битирозиновых сшивок, которые образуются за счёт взаимодействия между собой остатков тирозина из разных полипептидных цепей. Механизм образования битирозина включает генерацию тирозильных радикалов, радикальную изомеризацию, протекающую за счёт дирадикальных реакций, и, наконец, енолизацию:

 

                                                                                                                                      Битирозин

 

Битирозин – нормальный продукт посттрансляционных процессов в специфических структурных белках. В условиях окислительного стресса битирозин является одним из маркеров окислительного повреждения белков.

Металл-катализируемое окисление белков. В физиологических условиях и при патологических состояниях разной интенсивности может протекать МКО белков. Окисление аминокислотных остатков происходит в присутствии металлов переменной валентности (железо, медь), кислорода и Н2О2 и затрагивающее ту часть белковой молекулы, которая участвует в связывании металлов.

Серия экспериментальных исследований позволила Стедману и его коллегам сделать вывод, что МКО – это сайт – специфический процесс, в который вовлекаются Н2О2 и Fe2+ в области металл-связывающей поверхности белка. При физиологических условиях, когда концентрация ионов железа, меди и Н2О2 в тканях низкие, окислительное повреждение белков ограничивается модификацией аминокислотных остатков в области металл-связывающей поверхности белка.

Механизм МКО белков обусловлен функционированием специфических электрон-донорных систем. В этих системах должен присутствовать донатор электронов, который участвует в восстановлении О2 в Н2О2 и Fe3+ до Fe2+. Этот процесс может протекать либо по двухэлектронному пути с образованием Н2О2, либо по одноэлектронному пути с генерацией в начале О2 и последующей дисмутацией до Н2О2. Соответственно восстановление металлов, в частности Fe3+ в Fe2+, может проходить непосредственно за счет доноров электронов либо через промежуточное образование радикала О2. Последний взаимодействует с Fe3+, образуя Fe2+ и О2. Ионы железа фиксируются на металл-связывающей поверхности белка. Комплекс Fe2+-белок реагирует с Н2О2 и генерирует in situ радикал HO•, который вызывает окислительную модификацию аминокислотного остатка в области металл-связываю­щего участка белка (рис. 8). Это приводит к дезаминированию отдельных аминокислотных остатков ферментов, превращению их в карбонилпроизводные, потере белком каталитической активности и увеличению чувствительности к протеолитической деградации.

Рис. 8. Металл-катализируемая окислительная модификация белков

 

Один из возможных механизмов МКО рассмотрен на примере белка, у которого e-аминогруппа остатка лизина участвовала во взаимодействии с ионом Fe2+ с образованием Fe2+-белкового координационного комплекса. Реакция последнего с Н2О2 приводила к образованию HO•, ОНˉ и комплекса Fe3+-белок. Радикал HO• взаимодействовал с СН2-груп­пировкой, связанной с e-аминогруппой остатка лизина, образуя при этом радикал -СН•, который служил донором электронов для координационного комплекса Fe3+-белок с последующей генерацией комплекса Fe2+-белок. Это сопровождалось деструкцией металл-связывающей поверхности белка и диссоциацией Fe2+-белкового комплекса. Одновременно шло превращение аминогруппы лизинового остатка в иминогруппу с последующим ее дезаминированием и образованием карбонильного (альдегидного) производного (рис. 9).


Рис. 9. Возможный механизм сайт-специфического металл-катализируемого окисления белков

 

В результате МКО генерируются в основном карбонил-дериваты аминокислот. Показано, что карбонилпроизводные образуются в результате МКО пролиновых, аргининовых, лизиновых и гистидиновых остатков аминокислот, что может служить маркером разрушения белков за счет АФК при различных физиологических и патологических состояниях. Превращение основных аминокислот аргинина, лизина, гистидина в альдегиды и дальнейшее их окисление в карбоксильные группы ведут к снижению изоэлектрической точки белка.

Ароматические аминокислоты в отличие от аргининовых, лизиновых и гистидиновых остатков, реже входят в состав металл-связывающих поверхностей белков, поэтому они реже подвергаются воздействию МКО.

Образование гидропероксидов белков. Процесс протекает под влиянием HO• или О2, или кислорода, и связан с отщеплением Н+ от карбонильной группы аминокислот за счёт HO• и образованием в дальнейшем при взаимодействии с О2или О2 перекисных соединений:

PrH + Ox                          Pr• + reduced Ox

Pr• + O2                              PrOO•

PrOO• + e-                         PrOO–

PrOO- + H+                                   PrOOH

PrOO• + PrH                                 PrOOH + Pr•,

где PrH – белковая молекула, которая теряет атом водорода в первоначальной реакции с окислителем Ох; Pr• – углеродсодержащий свободный радикал, который должен иметь достаточное время жизни, необходимое для реакций с кислородом.

Пероксильные радикалы вступают в различные реакции, которые приводят к формированию альдегидов и кетонов, спиртов и гидропероксидов. Алифатические аминокислоты боковых цепей (валин, лейцин, изолейцин и пролин) легче образуют гидропероксиды; они могут также формироваться из ароматических колец и других аминокислот в реакциях с оксидантами.

 

Литература

1. Арчаков А.И., Мохосоев И.М. Модификация белков активным кислородом и их распад // Биохимия. – 1989. – Т. 54, вып. 2. – С. 179–186.

2. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение. – СПб., 2006. – 400 с.

3. Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях // Укр. бioxiм. журн. – 2008. – Т. 80, № 6. – C. 5–18.

4. Муравлева Л.Е., Молотов-Лучанский В.Б., Клюев Д.А., Бакенова Р.А., Култанов Б.Ж., Танкибаева Н.А., Койков В.В., Омарова Г.А. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования // Фундаментальные исследования. – 2010. – № 1. – С. 74–78.

5. Davies M.J. The oxidative environment and protein damage // Biochim Biophys Acta. – 2005. – V. 1703, № 2. – P. 93–109.

6. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies M.J. Biochemistry and pathology of radical mediated protein oxidation // Biochem. J. – 1997. – V. 324. – P. 1–18.

7. Gebicki J.M. Protein hydroperoxides as new reactive oxygen species // Redox Report. – 1997. – V. 3, № 2. – P. 99–110.

8. Hawkins C.L., Davies M.J. Generation and propagation of radical reactions on proteins // Biochem. Biophys. Acta. – 2001. – V. 1504. – P. 196–219.

9. Stadtman E.E. Metal-ion catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Rad. Biol. and Med. – 1990. – V. 9. – P. 315–325.

 

5.2. Определение окислительной модификации белков

плазмы крови по уровню карбонильных производных,

регистрируемых с помощью реакции с 2,4-динитрофенилгидразином

 

Интенсивность МКО белков можно оценивать с использованием различных методов, отражающих изменение гидрофобности белковых молекул, потерю гистидиновых остатков, изменение ультрафиолетового спектра белков. Однако при исследовании смесей белков наиболее информативным является определение карбонильных группировок аминокислотных остатков белков, образующихся в ходе их окислительной деструкции.

Наиболее распространенным является метод определения окислительной модификации белков плазмы по реакции образовавшихся карбонильных производных с 2,4-динитрофе­нилгидразином (2,4-ДНФГ). Этот метод оценки окислительной модификации белков основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-ДНФГ с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов (рис. 10), которые регистрируют спектрофотометрически.

Принцип метода. В результате окисления белков под действием свободных радикалов кислорода образуются альдегидные и кетонные группировки аминокислотных остатков (карбонильные группы), которые взаимодействуют с 2,4-ДНФГ с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона. Образующиеся 2,4-динитрофенилгидразоны имеют максимум поглощения около 370 нм.

Оборудование. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением, термостат, спектрофотометр.

 

 

Рис. 10. Схема образования карбонилов аминокислотных остатков боковых цепей белков и их взаимодействия с 2,4-динитрофенилгидразином на примере окисления аргинильного остатка (Nyström, 2005)

 

Реактивы и их приготовление. Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

1. 0,067 М раствор KH2PO4. В мерной колбе на 100 мл в воде растворяют 0,907 г KH2PO4.

2. 0,067 М раствор Na2HPO4·2H2O. В мерной колбе емкостью 100 мл в воде растворяют 11,866 г Na2HPO4·2H2O.

3. 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,4). 18,2 мл 0,067 М раствора KH2PO4 смешивают с 81,8 мл 0,067 М раствора Na2HPO4·2H2O. Проверяют pH на pH-метре.

4. 1 мМ раствор сульфата железа (II). 5,6 мг сульфата железа растворяют в 10 мл воды. Готовят перед опытом.

5. 1 мМ раствор ЭДТА. 6,4 мг ЭДТА растворяют в 10 мл воды.

6. 0,1 мМ раствор перекиси водорода. Готовят после установления исходной концентрации перекиси водорода путем титрования.

7. 20 %-ный раствор ТХУ.

8. 10 мМ раствор 2,4-ДНФГ. 200 мг 2,4-ДНФГ растворяют при нагревании на водяной бане в 100 мл 2 н. соляной кислоты. Раствор хранят в темной склянке при комнатной температуре в течение 1 месяца.

9. 2 н. раствор соляной кислоты. Готовят из фиксанала.

10. 8 М раствор мочевины. В мерной колбе на 50 мл растворяют в воде 24 г мочевины.

11. Этилацетат.

12. 96 %-ный этиловый спирт.

13. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Ход определения. Исследуют исходный уровень окисления белков, а также интенсивность этого процесса в инкубируемых пробах в отсутствие прооксидантов (спонтанный процесс) и в присутствии Fe2+– H2O2.

1. Определение исходного уровня окисления белков. В опытную пробирку вносят 0,05 мл неразведенной плазмы, 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера (pH 7,4), 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1,0 мл 20 %-ного раствора ТХУ. Контрольная проба содержит все указанные компоненты, но вместо 2,4-ДНФГ вносят такое же количество 2 н. соляной кислоты.

2. Определение уровня спонтанного окисления белков. В опытную и контрольную пробирки вносят 0,05 мл в 6 раз разведенной физраствором плазмы, 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера (pH 7,4). Пробы инкубируют 15 мин при 37 °С. По истечении времени в опытную пробу добавляют 1,0 мл 10 мМ раствора 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ вносят такой же объем 2 н. соляной кислоты.

3. Определение уровня Fe-зависимого окисления белков. В опытную и контрольную пробирки вносят 0,75 мл 0,067 М фосфатного буфера (pH 7,4), 0,05 мл 6 раз разведенной плазмы, 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ сульфата железа (1:1, готовят перед опытом) и 0,1 мл 0,1 мМ H2O2. Пробы инкубируют 15 мин при 37 °С. Затем в опытную пробирку добавляют 1,0 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1,0 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ вносят такой же объем 2 н. соляной кислоты.

Все пробы после добавления ТХУ оставляют на 1 ч при комнатной температуре, периодически перемешивая. По истечении времени пробы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок промывают 2 раза 4 мл смеси этилацетат – этиловый спирт (1:1). Промытые осадки белков высушивают либо в сушильном шкафу при 40 °С, либо помещением проб в холодильник на ночь без крышек. Высушенные осадки растворяют в 8 М растворе мочевины. Для чего к осадкам добавляют 3 мл 8 М раствора мочевины и по 1 капле 2 н. соляной кислоты. Пробы перемешивают и оставляют на 30 мин. Оптическую плотность пробы (Eon) измеряют на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя жидкости 1 см при длине волны 370 нм против контрольной пробы (Ек).

Содержание карбонильных групп (нмоль фенилгидразонов/мг белка) рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22000 моль–1·см–1 для ДНФГ-про­изводных, по формуле:

,

где DЕ =Eоп – Ек; V – конечный объем пробы (3 мл); С – содержание белка в пробе, мг; 106  – кофициент пересчета на нмоли.

 

5.3. Определение окислительной модификации мембранных белков эритроцитов

 

Отбор проб и их хранение. В опытах используют суспензию мембран эритроцитов.

Реактивы и их приготовление.

1. 1 мМ раствор сульфата железа (II).

2. 1 мМ раствор ЭДТА.

3. 0,1 мМ раствор перекиси водорода.

4. 20 %-ный раствор ТХУ.

5. 10 %-ный раствор ТХУ.

6. 0,1 н. раствор гидроксида натрия.

7. 10 мМ раствор 2,4-ДНФГ.

8. 2 н. раствор соляной кислоты.

9. 6 М раствор гуанидингидрохлорида.

10. Этилацетат.

11. 96 %-ный этиловый спирт.

12. Реактивы для определения белка по методу Лоури.

Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

Ход определения. Исследуют исходное содержание карбонильных групп в мембранных белках эритроцитов, а также интенсивность этого процесса в инкубируемых пробах в присутствии Fe2+–H2O2.

Пробы предварительно осаждают 20 %-ным раствором ТХУ и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, и осадок мембранных белков растворяют в 0,1 мл 0,1 н. NaOH в течение 5 минут.

При определении исходного уровня карбонильных групп белков в опытную пробирку вносят суспендированный осадок мембран эритроцитов, содержащий примерно 0,33 мг белка, 1 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-го раствора ТХУ. В контрольную пробирку вносят те же компоненты, кроме 2,4-ДНФГ, вместо него вносили 1 мл 2 н. HCl.

При определении карбонильных групп белков, стимулированных системой Fe2+–H2O2, в пробирку вносят суспендированный осадок мембран эритроцитов, содержащий примерно 0,33 мг белка, 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ сульфата железа (1:1, готовят перед опытом) и 0,1 мл 0,1 мМ H2O2. Пробы инкубируют 15 мин при 37 ºС. Затем в опытную пробирку добавляют 1 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ и 1 мл 20 %-ного раствора ТХУ. В контрольную пробирку вместо 2,4-ДНФГ вносят такой же объем 2 н. соляной кислоты.

Все пробы после добавления ТХУ оставляют на 1 час при комнатной температуре, перемешивая каждые 15 мин. По истечении времени пробы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадки промывают 2 раза – 4 мл смеси этилацетат-этиловый спирт (1:1) и 1 раз 4 мл 10 %-ного раствора ТХУ для отмывания белков от несвязавшегося ДНФГ и липидов.

Промытые осадки высушивают либо в сушильном шкафу при 40 ºС, либо помещением пробирок в холодильник на ночь без крышек.

Высушенные осадки растворяют в 3 мл 6 М раствора гуанидингидрохлорида. Пробы перемешивают и оставляют на 30 минут. Содержание белка в контрольной пробе определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Уровень карбонильных групп, измеренный по поглощению при 370 нм против контрольной пробы, рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22000 М–1·см–1 для ДНФГ-производных.

,

где Х= содержание фенилгидразонов в нмолях на 1 мг белка; С – содержание белка в пробе, мг; 106  – кофициент пересчета на нмоли.

 

Литература

1. Дубинина Е.Е., Леонова Н.В., Зыбина Н.Н., и др. Окислительная деструкция белков, особенности окислительной модификации белков с использованием модельных систем и в плазме крови пожилых людей с деменциями // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии: Труды конф. – СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1998. – Т. 2. – С. 425–429.

2. Levine R.L., Garlana D., Oliver C.N., etc. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins // Methods in Enzymol. – 1990. – V. 186. – P. 464–478.

3. Nyström T. Role of oxidative carbonylation in protein quality control and senescence // EMBO J. – 2005. – V. 24. – P. 1311–1317.

4. Venditti P., Rosa R.D., Meo S.D. Effect of cold-induced hyperthyriodism on H2O2 production and susceptibility of stress conditions of rat liver mitochondria // Free Rad. Biol. Med. – 2004. – V. 36, № 3. – P. 348–358.

 

5.4. Определение окислительной модификации белков в тканях

 

Реактивы и их приготовление.

1. Гомогенизирующий буфер: 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 % дигитонина, коктейль антипротеаз (40 мкг/мл фенилметилсульфонилфлуорида, 5 мкг/мл лейпептина, 7 мкг/мл пепстатина, 5 мкг/мл апротонина) и 1 мМ ЭДТА.

2. 10 % раствор стрептомицина сульфата в 50 мМ фосфатном буфере.

3. 2,5 М раствор HCl.

4. 10 мМ раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2,5 М HCl.

5. 20 % раствор ТХУ.

6. 10 % раствор ТХУ.

7. Смесь этанол-этилацетат (1:1).

8. 6 М раствор гуанидингидрохлорида, содержащий 20 мМ фосфат калия, рН доводят до 2,3 концентрированной HCl.

Ход определения. Приготовление гомогената. 300 мг ткани гомогенизируют в 6 мл гомогенизирующего буфера. Гомогенат инкубируют 15 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин. Измеряют абсорбцию супернатанта при 280 и 260 нм. Если отношение 280/260 < 1, приступают к удалению нуклеиновых кислот при помощи стрептомицина сульфата.

Удаление нуклеиновых кислот. При работе с тканевыми гомогенатами необходимо дополнительно провести осаждение присутствующих в тканях нуклеиновых кислот, которые могут заведомо ошибочно повышать уровень карбонильных производных белкового происхождения. Осаждение нуклеиновых кислот осуществляется с помощью 10 % раствора стрептомицина сульфата в 50 мМ HEPES (рН 7,2). К 1 объему раствора стрептомицина сульфата добавляют 9 объемов тканевого гомогената, концентрация белка в котором должна быть не более чем 5 мг/мл, и оставляют на 15 мин при комнатной температуре. Затем центрифугируют при 6000 g в течение 10 мин и используют для работы надосадочную жидкость.

Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином. В две стеклянные пробирки вносят по 1 мл экстракта белков (около 0,7–1,0 мг). В опытную пробу приливают 4 мл 10 мМ ДНФГ в 2,5 М HCl, в контрольную – то же количество 2,5 М HCl. Пробы оставляют при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте, периодически встряхивая каждые 10–15 мин. Затем в обе пробы добавляют по 5 мл 20 % ТХУ, выдерживают на льду в течение 10 мин. Для осаждения белков пробы центрифугируют при 11000 g, надосадочную жидкость сливают. Осадки ресуспендируют в 4 мл 10 % ТХУ и снова осаждают при тех же условиях. Осадки трижды промывают 3 мл смеси этанола c этилацетатом (1:1) с целью удаления непрореагировавщего 2,4-ДНФГ и примесей липидов. Конечные осадки растворяют в 2 мл 6 М гуанидингидрохлорида и оставляют на 10 мин при 37 °С, перемешивая. Нерастворимые частицы удаляют дополнительным центрифугированием.

Количество образовавшихся 2,4-ДНФГ-гидразонов регистрируют при длине волны 370 нм против контрольной пробы. Для расчета используют коэффициент молярной экстинкции 22000 М–1см–1.

Содержание белка в пробах определяют по спектрофотометрическому методу. Для этого осадки, полученные в контрольной пробе (содержащие 2,5 М HCl), растворяют в 6 М гуанидингидрохлориде и оптическую плотность измеряют при длине волны 280 нм. Содержание белка рассчитывается по калибровочному графику, построенному по бычьему сывороточному альбумину (концентрация 0,25–2,0 мг/мл), растворенному в 6 М гуанидингидрохлориде. Оптическая плотность измеряется при 280 нм.

Содержание карбонилов, выраженное в нмолях на мг белка расчитывают по формуле:.

,

где DE = Eon – Eк; С – содержание белка в пробе; 106 – коэффициент перевода на нмоли.

 

Литература

Reznick A.Z., Packer L. Oxidative damage to proteins: spectrophotometric method for carbonyl assay // Methods Enzymol. – 1994. – V. 233. – P. 357–363.

 

 

5.5. Определение окисляемости белков сыворотки и плазмы крови

 

Принцип метода. Степень спонтанной и медь-инициированной модификации белков плазмы и сыворотки крови после инкубации последних при 37 °С в течение 20 часов определяют по уровню карбонильных групп по реакции с 2,4-ДНФГ.

Отбор проб и их хранение. В работе используют сыворотку и плазму крови. При получении плазмы крови в качестве антикоагулянта используют 3,8 % раствор цитрата натрия (1:9). Плазму и сыворотку перед использованием разводят буферно-солевым раствором (1:20).

Оборудование. Низкоскоростная центрифуга с охлаждением, термостат, спектрофотометр.

Реактивы и их приготовление. Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

1. Буферно-солевой раствор. 150 мМ NaCl, приготовленный на 10 мМ натрий-фосфатном буфере (8,1 мМ NaН2РО4, 1,9 мМ Na2НРО4), рН 7,4.

2. 200 мкМ раствор CuSO4·5Н2О.

3. 20 %-ный раствор ТХУ.

4. 2,5 мМ раствор 2,4-ДНФГ, приготовленный на 2,5 М растворе соляной кислоты.

5. 2,5 М раствор соляной кислоты.

6. 10 М раствор мочевины.

7. Этилацетат.

8. 96 %-ный этиловый спирт.

Ход определения. Исследуют исходный уровень карбонильных групп, а также их накопление в присутствии ионов меди в инкубируемых в течение 20 часов пробах.

1. Определение исходного уровня карбонильных групп. В опытную пробирку вносят 0,2 мл 20 раз разведенной плазмы (сыворотки) и 1,0 мл 2,5 мМ 2,4-ДНФГ, растворенного в 2,5 М НСl, контрольную пробу вместо 2,4-ДНФГ добавляют 1,0 мл 2,5 М в НСl. Все пробы инкубируют в течение 1 часа при 25 °С в темноте, затем добавляют 1 мл охлажденного 20 % раствора ТХУ.

2. Определение окисляемости белков. К 0,9 мл 20 раз разведенной плазмы (сыворотки) добавляют 0,1 мл 200 мкМ раствора CuSO4·5Н2О. Пробы инкубируют при 37 °С в течение 20 ч. По истечении времени из опытных и контрольных образцов отбирают 0,2 мл для определения карбонилов, как описано выше.

Все пробы после добавления ТХУ выдерживают 10 мин на холоде. По истечении времени пробы центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок промывают 2 раза смесью этилацетат-этиловый спирт (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Для этого к осадку добавляют 2 мл смеси этанол:этилацетат (1:1). Осадок ресуспендируют и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Затем процедуру повторяют. Промытые осадки белков высушивают либо в сушильном шкафу при 40 °С, либо помещением проб в холодильник на ночь без крышек. Высушенные осадки растворяют в предварительно нагретых 2 мл 10 М раствора мочевины на кипящей водяной бане.

Оптическую плотность проб (Eоп) измеряют на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя жидкости 1 см при длине волны 370 нм против контрольной пробы (Ек).

Содержание карбонильных групп (нмоль фенилгидразонов/мг белка) рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22000 моль–1·см–1 для ДНФГ-про­изводных, по формуле:

,

где DЕ =Eоп – Ек; V – конечный объем пробы (2 мл); С – содержание белка в пробе, мг; 106  – коэффициент пересчета на нмоли.

Для определения концентрации белка в плазме используют биуретовый метод.

 

Литература

Азизова О.А., Пирязев А.П., Москвина С.Н., Асейчев А.В. Метод определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови // Биомед. химия. – 2007. – Т. 53, вып. 1. – С. 99–106.

 

 

5.6. Определение железо-зависимого образования битирозина и окисления триптофана в белках

 

Как было отмечено выше, высокой чувствительностью к окислению обладают ароматические остатки аминокислот (фенилаланин, тирозин). При окислении фенилаланина образуются о- и м-тирозины, а тирозина – битирозин и 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА):

 

                                                                    Битирозин                                   ДОФА

                                                                                                           (3,4-дигидроксифенилаланин)

 

Поскольку битирозин чаще участвует в образовании связей между белковыми молекулами, чем внутри молекул, это может быть одним из важных факторов агрегации белков под действием АФК.

В случае окисления триптофановых остатков генерация радикальных соединений связана с бензольным (А) – 40 % и пирольным (Б) – 60 % кольцами:

А

Б

 

У перокси-радикалов, образовавшихся в результате первоначального радикального присоединения О2 к С-3 положению пирольного кольца, в последующем раскрываются кольца с образованием N-формилкинуренина:

 

N-формилкинуренин

 

Удачным маркером окислительного повреждения белков является битирозин, стабильный в присутствии различных протеаз. Дополнительная обработка белков с помощью протеаз позволяет повысить чувствительность метода за счет устранения продуктов их модификации, обладающих сходной флуоресцентной характеристикой. К этим соединениям относятся продукты окисления триптофана (N-формилкин­уренин), аддукты ретиноевой кислоты с белками, конъюгация 4-гидроксиноненала с лизиновыми остатками белков.

Е.Е. Дубинина разработала адаптированную методику оценки интенсивности металлкатализируемого окисления белков по степени окисления тирозиновых и триптофановых остатков очищенных белков.

Принцип метода. Окислительная модификация тирозиновых остатков белков сопряжена с образованием битирозина, который обладает характерной голубой флуоресценцией. Окисление триптофановых остатков сопровождается снижением флуоресценции, характерной для триптофана.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,067 М фосфатный буфер (pH 7,4). 18,2 мл 0,067 М раствора KH2PO4 смешивают с 81,8 мл 0,067 М раствора Na2HPO4·2H2O. Проверяют pH на pH-метре.

2. 65 мкМ FeSO4.

3. 85 мкМ ЭДТА.

4. 0,6 мМ Н2О2.

В качестве системы, инициирующей металлкатализируемое окисление белков, используют среду Фентона, состоящую из смеси растворов 65 мкМ FeSO4 и 85 мкМ ЭДТА в соотношении 1:1 и 0,6 мМ Н2О2. Концентрация белка в пробах составляет 0,5 мг/мл.

Ход определения. Контрольная проба содержит: 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера (рН 7,4) и 0,05 мл раствора очищенного белка. Опытная проба содержит: 0,85 мл 0,067 фосфатного буфера (рН 7,4), 0,05 мл раствора белка, 0,05 мл смеси растворов 65 мкМ FeSO4 и 85 мкМ ЭДТА в соотношении 1:1 и 0,05 мл 0,6 мМ Н2О2. Обе пробы инкубируют при 37 °С в течение 1, 2 и 24-х часов. По истечении инкубации интенсивность окислительной модификации белков оценивают по степени образования битирозиновых сшивок и по снижению флуоресценции триптофана. Измерения проводят на спектрофлуориметре под углом 90° по отношению к возбуждающему лучу. Изменения триптофана регистрируют при длине волны возбуждения λ = 295 нм и длине волны испускания λ = 340 нм. Образование битирозина регистрируют при длине волны возбуждения λ = 325 нм и длине волны испускания λ = 415 нм.

Полученные данные можно представить в виде процентов по отношению к контрольным пробам, в которых отсутствуют компоненты системы Фентона.

 

Литература

Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение. – СПб., 2006. – 400 с.