4

Глава 4. Методы определения продуктов перекисного окисления липидов

4.1. Определение первичных продуктов перекисного окисления липидов в крови

Анализ радикальных продуктов свободнорадикального окисления липидов очень труден из-за нестабильности этих соединений. Поэтому широкое распространение получили методы анализа молекулярных продуктов этого процесса. Продукты ПОЛ делят на первичные, вторичные и конечные. Первичными продуктами ПОЛ являются гидроперекиси липидов, при образовании которых в молекуле жирной кислоты формируются сопряженные двойные связи – диеновые конъюгаты (рис. 5).

Рис. 5. Схематическое изображение формирования диеновых конъюгатов в ходе перекисного окисления липидов

Возможно также образование конъюгированных триенов. Липидные экстракты, содержащие гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот с такими группировками в своей структуре, обладают поглощением в УФ-области спектра: для диеновых конъюгатов при λ = 232 нм и для конъюгированных триенов при λ = 275 нм. Следует отметить, что величина диеновых конъюгатов и конъюгированных триенов зависит от жирнокислотного состава. Степень окисленности липидов можно определить также по соотношению содержания в них продуктов, поглощающих УФ-излучение на разной длине волн, т. е. по отношению 232/215 нм (индекс окисления), где 215 нм – это максимум поглощения неокисленных (насыщенных) липидов.

Принцип метода. Смесью гептан-изопропиловый спирт извлекают липиды крови. Гептан экстрагирует в основном нейтральные липиды, а изопропанол – фосфолипиды. Таким образом, становится возможным определение продуктов липопероксидации в различных классах липидов. В липидных экстрактах каждой фазы измерения производят при 220 нм (в диапазоне 186–225 нм поглощают ультрафиолетовые лучи изолированные двойные связи), 232 нм (поглощение отражает содержание диеновых конъюгатов) и 278 нм (поглощение зависит от содержания кетодиенов и сопряженных триенов).

Оборудование: качалка, центрифуга на 6000 об./мин, спектрофотометр СФ-46.

Реактивы и их приготовление.

1. Гептан.

2. Изопропиловый спирт (2-пропанол).

3. 1 %-ный раствор ЭДТА, приготовленный на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия.

4. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

5. 1 н. соляная кислота.

Ход определения. К 5 мл смеси гептан-изопропанол (1:1 по объему) добавляют 0,5 мл цельной крови и экстрагируют липиды, встряхивая на качалке в течение 15 мин. Затем после центрифугирования проб при 5000 об./мин в течение 10 мин липидные экстракты сливают в мерные пробирки с притертой пробкой и разбавляют 5 мл смеси гептан-изопропанол (3:7 по объему). Последнюю процедуру выполняют с целью достижения оптимальных значений оптической плотности в обеих фазах экстракта. К разбавленным липидным вытяжкам для разделения и отмывки от нелипидных примесей добавляют 2 мл 1 н. соляной кислоты. После интенсивного встряхивания пробы оставляют на 15 мин при 4 °С для разделения фаз.

По истечении времени гептановую фазу отбирают в отдельную сухую пробирку, а к водно-спиртовой фазе добавляют 1 г хлорида натрия для обезвоживания изопропанольного экстракта. Пробы встряхивают и оставляют на 10 мин для разделения фаз. После отделения водной фазы изопропанол переносят в отдельную пробирку. Оптические контроли готовят путем экстракции по схеме, описанной выше, но вместо крови берут 0,5 мл 0,1 % раствора ЭДТА на 0,9 %-ном растворе хлорида натрия. Измеряют оптическую плотность каждой фазы против соответствующего контроля при 220, 232 и 278 нм. Расчеты содержания продуктов ПОЛ производят, соотнося величины соответствующих экстинкций с 1 мл исследуемой крови, по формуле:

Е/мл крови =

(для гептановой фазы: = Е·8; для изопропанольной фазы: = Е·12).

4.2. Определение первичных продуктов перекисного окисления липидов в мозге

Принцип метода (см. методику определения первичных продуктов ПОЛ в крови).

Отбор проб и их хранение. Из мозга готовят 10 %-ный гомогенат на 0,067 М фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА, и сразу же используют в опыте.

Оборудование. Гомогенизатор с тефлоновым пестиком, низкоскоростная центрифуга, качалка, спектрофотометр.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,067 М фосфатный буфер (рН 7,4).

2. 0,067 М фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 1 мМ ЭДТА. В мерной колбе емкостью 100 мл растворяют в 0,067 М фосфатном буфере 87,2 мг ЭДТА, и доводят объем до метки.

3. Остальные реактивы те же, что и для определения продуктов ПОЛ в крови.

Ход определения. К 9 мл смеси гептан-изопропанол (1:1 по объему) добавляют 1 мл 10 %-ного гомогената мозга. Экстракцию липидов производят в течение 15 мин путем встряхивания на качалке. Пробы центрифугируют при 5000 об./мин в течение 10 мин. Липидные экстракты сливают в сухие пробирки с притертой пробкой. Дальнейший ход анализа аналогичен процедуре для крови.

В качестве контроля служат пробы, в которые вместо гомогената вносят 1 мл 0,067 М фосфатного буфера 0,067 М (рН 7,4), содержащего 1 мМ ЭДТА.

Расчет содержания продуктов ПОЛ проводят, относя величины соответствующих экстинкций с 1 мг ткани по формуле:

где Е – оптическая плотность пробы относительно контроля; V – объем соответствующего липидного экстракта; С – содержание ткани в пробе, мг.

Литература

Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лившиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови // Вопр. мед. химии. – 1989. – Т. 35. – № 1. – С. 127–131.

4.3. Определение продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой в сыворотке и плазме крови

Малоновый диальдегид (МДА) является низкомолекулярным соединением с мол. массой 72,07. МДА образуется лишь при окислении жирных кислот 18:3 и 20:4, а также быстро метаболизируется в митохондриях. Кроме того, в живых системах МДА взаимодействует с макромолекулами, содержащими первичные аминогруппы, например, белками, фосфолипидами и нуклеиновыми кислотами. В результате этой реакции образуются поперечные сшивки между макромолекулами, что уменьшает их конформационную подвижность, делает их токсичными, а также наделяет свойствами мутагенов и канцерогенов.

Существует два больших класса аналитических методов определения МДА: прямые методы, в которых анализируется МДА сам по себе, и непрямые методы оценки продуктов реакции МДА с другими соединениями.

Из непрямых методов наиболее распространенным стал метод с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Тест с ТБК очень чувствителен. С его помощью можно улавливать наномолярные концентрации МДА-стандарта. В то же время этот метод оценки МДА имеет ряд недостатков: он неспецифичен, так как ТБК реагирует не только с МДА, но и со многими другими соединениями (ароматическими альдегидами, аминокислотами, дезоксисахарами, сиаловыми кислотами, гликозилированными белками). Возможно, в условиях высокой температуры ТБК реагирует с МДА, образованным из гидроперекисей в ходе реакции.

малоновый диальдегид

Тем не менее, метод определения МДА в тесте с ТБК широко используется для оценки интенсивности процессов ПОЛ. Это связано с тем, что между липидной пероксидацией и МДА существуют количественные взаимосвязи и продукты, образованные при проведении ТБК-теста, свидетельствуют о присутствии и количестве липидных перекисей.

Принцип метода. Исследование интенсивности ПОЛ ведут, определяя один из промежуточных продуктов перекисного окисления – МДА – с помощью ТБК. МДА и ТБК при высокой температуре и кислом значении pH образуют окрашенный триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы ТБК. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.

Оборудование. Водяная баня, центрифуга со скоростью 6000 об./мин, колориметр КФК-3 или спектрофотометр.

Реактивы и их приготовление.

1. 1 %-ный раствор ортофосфорной кислоты (плотность раствора должна соответствовать 1,004 г/мл). 3,4 мл концентрированной кислоты (86,8 % с плотностью 1,705 г/мл) разбавляют дистиллированной водой до 500 мл.

2. 0,6 %-ный водный раствор тиобарбитуровой кислоты. Растворяют при небольшом нагревании.

3. 0,28 %-ный раствор сульфата железа (II). 28 мг сульфата железа растворяют в 10 мл дистиллированной воды.

4. Бутанол.

Ход определения. К 0,2 мл сыворотки (плазмы) крови приливают 3 мл 1 %-ного раствора фосфорной кислоты, 1 мл 0,6 % ТБК и 0,1 мл раствора сернокислого железа (железо необходимо для полного разрушения липоперекисей), что соответствует 1 мкмоль в пробе. Пробирки ставят в кипящую водную баню на 1 ч. Затем их охлаждают в холодной воде, добавляют 4 мл бутанола. Тщательно перемешивают и центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин. Оптическую плотность верхней бутанольной фазы измеряют при длине волны 515 и 532 нм против бутанола. Расчет содержания продуктов, реагирующих с ТБК, производят с учетом коэффициента молярной экстинкции МДА, равного 1,56·10⁵ моль^–1см^–1:

где X – содержание МДА (в мкмоль/л или нмоль/мл); 4 – объем бутанольной фазы; 0,2 – объем сыворотки; DЕ = Е₅₃₂ – Е₅₁₅.

Литература

Андреева Л.И., Кожемякина А.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбиталовой кислотой // Лаб. дело. – 1988. – № 11. – С. 41–43.

4.4. Определение содержания ТБК-активных продуктов в эритроцитах крови

Реактивы.

1. Раствор ТХУ, 170 г/л.

2. Раствор ТБК, 8 г/л.

3. Раствор хлорида натрия, изотонический, 0,15 моль/л (9 г/л).

Ход определения. Для исследования отбирают 0,1 мл эритроцитов, трижды отмытых охлажденным изотоническим раствором, и гемолизируют внесением в пробирку 2 мл дистиллированной воды. К полученному гемолизату добавляют 1 мл раствора ТХУ и 1 мл раствора ТБК. Пробу прогревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин.

Интенсивность окраски измеряют при длине волны 540 нм (желательно на спектрофотометре) в кювете с толщиной слоя 1 см против контрольной пробы (вместо эритроцитов вносится 0,1 мл физ. раствора и проводится через все вышеперечисленные процедуры). Для проведения расчётов используют формулу:

С (мкмоль/л) = ,

где Е_оп – оптическая плотность опытной пробы; 4 мл – объем водной фазы; 0,1 мл – объём эритроцитарной массы; 10⁶ – коэффициент перевода «моль/л» в «мкмоль/л»; 1,56·10⁵ – коэффициент молярной экстинкции.

Литература

Андреева Л.И., Кожемякина А.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбиталовой кислотой // Лаб. дело. – 1988. – № 11. – С. 41–43.

4.5. Определение содержания ТБК-активных продуктов

перекисного окисления липидов в синаптосомах

Реактивы и их приготовление.

1. 0,67 % раствор ТБК.

2. 10 % раствор ТХУ.

3. 20 % раствор додецилсульфата натрия.

Ход определения. Синаптосомы суспендировали в среде, содержащей (в моль/л): NaCl – 132; KCl – 5; MgCl₂ – 1,3; NaH₂PO₄ – 1,2; CaCl₂ – 1,0; трис-малеат – 10; рН 7,4. Белок определяли по методу Лоури.

0,1 мл суспензии синаптосом с концентрацией белка 1–2 мг/мл вносят в 0,9 мл инкубационной среды. В контрольную пробу вместо суспензии синаптосом вносят 0,1 мл физ. раствора. После 40 мин инкубации в шейкере (37 °С) к суспензии добавляют 1 мл смеси, состоящей из 0,67 % ТБК, 10 % ТХУ, 20 % додецилсульфата натрия в соотношении 10:9:1. Смесь помещают в кипящую баню на 15 мин и затем охлаждают до 0 °С. Оптическую плотность определяют против контрольной пробы. Концентрацию ТБК-продуктов в пересчёте МДА определяют, исходя из коэффициента молярной экстинкции Е₅₃₂ = 1,5·10⁵ л/моль на спектрофотометре в двухлучевом режиме 532 нм против 560 нм и выражают в нмолях на 1 мг белка.

Литература

Лысакова Т.И., Аксенцев С.Л., Федорович С.В., и др. Влияние факторов ишемического повреждения на перекисное окисление липидов в синаптосомах мозга крыс // Биофизика. – 1997. – Т. 42, вып. 2. – С. 408–411.

4.6. Определение интенсивности процессов перекисного окисления

липидов в гомогенатах головного мозга

Принцип метода. Об интенсивности перекисного окисления липидов судят по накоплению в среде инкубации одного из промежуточных продуктов – МДА.

Отбор проб и их хранение. Из больших полушарий головного мозга (или другого отдела мозга) на 0,1 М трис-HCl буфере (рН 7,4 при 37 °С), готовят 10 %-ный гомогенат. Полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя нейлоновой ткани или центрифугируют при 1500 об./мин в течение 10 мин. Фильтрат или супернатант хранят на холоде.

Оборудование. Гомогенизатор с тефлоновым пестиком, низкоскоростная центрифуга с охлаждением, спектрофотометр.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С). 6,057 г триса растворяют в 450 мл дистиллированной воды и 1 н. HCl рН доводят до 7,4 при 37 °С. Общий объем водой доводят до 500 мл.

2. 40 мМ раствор НАДФН. 33 мг тетранатриевой соли НАДФН растворяют в 1 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

3. 160 мМ раствор АДФ. 75,4 мг динатриевой соли АДФ растворяют в 1 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

4. 0,479 мМ раствор соли Мора. 9,4 мг соли (NH₄)Fe(SO₄)₂·6H₂O растворяют в 50 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

5. 20 мМ раствор аскорбиновой кислоты. 7 мг кислоты растворяют в 2 мл 0,1 М трис-HCl буфера.

6. 0,75 %-ный раствор ТБК. Готовят при небольшом нагревании на дистиллированной воде.

7. 30 %-ный раствор ТХУ.

Растворы НАДФН, АДФ, аскорбиновой кислоты и ТБК готовят ежедневно перед работой и хранят на холоде.

Ход определения. Исследуют исходный уровень ПОЛ, а также интенсивность процессов ПОЛ в инкубируемых пробах в отсутствие прооксидантов (для определения спонтанного ПОЛ), в присутствии НАДФН (ферментативный ПОЛ) и Fe²⁺ + аскорбата (неферментативный ПОЛ). При определении НАДФН-зависимого ПОЛ среда инкубации содержит 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С), 1 мМ НАДФН, 4 мМ АДФ и 12 мкМ соль Мора, а при аскорбат-зависимом ПОЛ – 0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4 при 37 °С), 0,5 мМ аскорбат и 12 мкМ соль Мора.

Для работы берут 12 пробирок по 3 на каждый анализ (из них 1 контрольная и 2 опытные). В пробирки наливают растворы в соответствии с табл. 3.

Таблица 3. Последовательность смешивания растворов (мл) для определения интенсивности процессов ПОЛ в мозге

№	Раствор	ПОЛ
№	Раствор	Исходный уровень	Спонтанный	НАДФН-зависимый	Аскорбат-зависимый
1	0,1 М трис-HCl буфер (рН 7,4)	3,8	3,8	3,5	3,6
2	40 мМ НАДФН	-	-	0,1	-
3	0,16 мМ АДФ	-	-	0,1	-
4	0,48 мМ соль Мора	-	-	0,1	0,1
5	20 мМ аскорбат	-	-	-	0,1
6	Гомогенат	0,2	0,2	0,2	0,2
7	30 % ТХУ	2,0	2,0	2,0	2,0
8	0,75 % ТБК	2,0	2,0	2,0	2,0

При исследовании исходного уровня ПОЛ в ткани мозга к среде, содержащей 3,8 мл 0,1 М трис-HCl буфера и 2,0 мл 30 %-ного раствора ТХУ, добавляют 0,2 мл гомогената и после перемешивания пробы сразу прогревают 15 мин на кипящей водяной бане.

При определении скорости спонтанного НАДФН- и аскорбат-зависимого ПОЛ пробы после добавления соответствующих реактивов и гомогената инкубируют 10 мин при 37 °С. По истечении времени в каждую пробу добавляют 2 мл 30 %-ного раствора холодного ТХУ, тщательно перемешивают. Затем добавляют 2 мл 0,75 %-ного раствора ТБК, перемешивают и ставят на 15 мин в кипящую водяную баню. Пробы охлаждают и центрифугируют при 4000 об./мин в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют оптическую плотность при длине волны 532 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм против слепой пробы, содержащей 4 мл 0,1 М трис-HCl буфера, 2 мл 30 %-ного раствора ТХУ и 2 мл 0,75 %-ного раствора ТБК и проведенной через вышеописанные процедуры.

Расчет содержания МДА (нмоль/г ткани) в мозге производят по следующей формуле:

где Е – оптическая плотность; V – конечный объем пробы (8 мл); 1,56·10⁵ – коэффициент молярной экстинкции; С – навеска ткани (г).

О скорости неиндуцированных (спонтанных) и индуцированных прооксидантами (НАДФН- и аскорбат-зависимых) процессов пероксидации липидов тканей мозга судят по разности количества МДА до и после 10 мин инкубации.

Литература

Лемешко В.В., Никитченко Ю.В., Свич И.В., Овсянников С.Е. Перекисное окисление липидов биомембран и его ферментативная регуляция при старении крыс // Укр. биохим. журн. – 1987. – Т. 59, № 2. – С. 50–57.