Глава 3. Методы определения активных форм кислорода и продуцирующих их систем

3.1. Образование NO в организме

NО синтезируется из гуанидинового атома азота L-аргинина семейством цитохром-Р450-подобных гемопротеинов – NО-синтаз (NОS), которые присоединяют молекулярный кислород к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина. NОS в реакции с L-аргинином одновременно с NО продуцируют неактивный конечный продукт – L-цитруллин, который является маркером активности NОS. В области гема происходит связывание L-аргинина и молекулы кислорода и осуществляется основная реакция – окисление L-аргинина с выделением из него молекулы NO в свободной форме. Суммарное уравнение катализируемой NOS реакции включает пятиэлектронное (N^3-→N²⁺) окисление атома азота аргинина, сопряженное с окислением НАДФН:

2L-аргинин + 3НАДФН₂ + 4O₂ + 3H⁺→ 2L-цитруллин + 2NO + 3НАДФ⁺ + 4H₂O

Некоторые характеристики синтазы оксида азота. Ферменты, катализирующие продукцию большей части NO, уникальны по сложности организации, включают рекордное число разнообразных кофакторов: ФМН, ФАД, гем и кальций-кальмодулин и, по крайней мере, 3 субстрата – аргинин, кислород и НАДФН.

В неактивном состоянии NOS представляет собой мономер, содержащий пять мест связывания для 5 разных кофакторов (рис. 3). При наличии в окружающей среде всех кофакторов и аргинина происходит димеризация NOS и фермент становится активным.

В каждом мономере различают несколько дискретных доменов (рис. 3). Начиная с С-конца, различают редуктазный домен, имеющий высокую степень гомологии с цитохром-Р450-редуктазой; небольшой кальмодулинсвязывающий домен; оксигеназный домен, обладающий многими характеристиками цитохром-Р450-редуктазы, но без структурной гомологии с последней; N-концевую последовательность, специфичную для каждой изоформы. Редуктазный домен содержит два флавиновых кольца – одно в виде ФАД, другое – ФМН. ФАД является первичным акцептором электронов от НАДФН, а ФМН переносит электроны от ФАД на гем в оксигеназном домене. Оксигеназный домен содержит участки связывания для гема, Арг и ВН₄. На этом домене происходит окисление аргинина с выделением из него молекулы NO.

Рис. 3. Схематическое представление синтеза NО и регуляции работы NO-синтазы. ВН₄ – тетрагидробиоптерин; СаМ – кальмодулин

По характеру индукции и действия синтазы оксида азота разделяются на два класса. Первый класс составляют кальций-кальмодулинзависимые, конститутивно экспрессируемые физиологическими факторами NОS. Конститутивные NОS подразделяются на нейрональную (nNOS, тип I) и эндотелиальную (еNОS, тип III) изоформы. Они обеспечивают синтез NO в физиологических условиях. Конститутивные NOS обнаружены во многих клетках органов и тканей. Что касается особенностей локализации, то nNOS, как было установлено, в большом количестве присутствует в нейронах, эндотелиальных клетках, в т. ч. эндотелии эфферентной артериолы почек, в тромбоцитах и др. eNOS локализуется в больших количествах в эндотелии и, в частности, в тромбоцитах, интерлобулярной и афферентной артериолах, эфферентной артериоле, а также в гломерулах, мезангиальных клетках и др. Молекулярная масса субъединиц eNOS составляет 135 кДа, а nNOS – 160 кДа.

Во второй класс синтаз оксида азота входит кальций-независимая, индуцибельно экспрессируемая NОS (iNOS, тип II). Молекулярная масса субъединиц iNOS составляет 130 кДа. iNOS обнаружена в различных клетках органов и тканей. Индуцибельные формы NOS в физиологических условиях неактивны. Синтез их увеличивается в ответ на действие патогенных стимулов. При активации iNOS происходит продолжительное повышение генерации NО.

Основные функциональные различия изоформ заключаются в том, что Са²⁺ необходим для активации eNOS и nNOS, в то время как кальмодулин связан с iNOS столь прочно, что наличие Са²⁺ в среде не является необходимым. Эндотелиальная NOS демонстрирует свою активность только в присутствии кальция и кальмодулина. Увеличение продукции NO происходит пропорционально поступлению в цитоплазму кальция либо извне, либо из эндоплазматического ретикулума (при действии ацетилхолина, брадикинина и других агентов, стимулирующих реакции фосфатидилинозитолфосфатного цикла).

Поступление ионов кальция в цитоплазму нейронов через каналы, возбуждаемые аминокислотами, приводит к активации nNOS, увеличению продукции NO и активации гуанилатциклазы.

Механизмы регуляции активности iNOS. В культуре мезангиальных клеток интерлейкин-1β и вещества, повышающие концентрацию цГМФ, индуцируют экспрессию гена iNOS. Это приводит к повышению активности фермента и образованию NO. К настоящему времени установлено, что кроме интерлейкина-1β синтез iNOS индуцируется интерфероном-γ, фактором некроза опухолей (TNFα), липополисахаридами грамотрицательных бактерий. Пик продукции этой формы NOS достигается по одним источникам через 6 ч, по другим – через 12 ч после начала действия индуктора. К этому времени независимая от кальция продукция NO достигает уровня, при котором начинает сказываться влияние NO не только на гуанилатциклазу, но и на железосодержащие компоненты дыхательной цепи митохондрий, на аконитазу, рибонуклеотидредуктазу. В результате этого в клетках, подвергнутых действию таких количеств NO, нарушается энергетический обмен и синтез ДНК. В организме эта способность оксида азота используется для уничтожения опухолевых клеток макрофагами, которые не только сами производят NO, но и секретируют фактор некроза опухолей, который вызывает индукцию NOS в опухолевых и других клетках.

3.2. Определение нитратов в плазме крови

Количественное определение концентрации NO в тканях затруднено из-за короткого времени жизни этого свободного радикала. Для оценки продукции NO наиболее часто применяется измерение концентрации стабильных метаболитов NO – нитритов и нитратов, в биологических жидкостях.

В плазме крови нитрит образуется при аутоокислении NO, который синтезируется эндотелиальной NO-синтазой:

2NO + О₂ → 2NO₂

NO + NO₂ → N₂O₃ → NO₂^– + NO⁺

(NO⁺ может участвовать в формировании S-нитрозотиолов и N-нитрозоаминов).

Плазменный уровень нитритов коррелирует с активностью эндотелиальной NO-синтазы, и поэтому NO₂^– считают маркером активности этого фермента. При нормоксии нитриты окисляются в нитраты при участии оксигемоглобина.

Нитриты считают депо NO. Образовавшийся нитрит поступает в эритроцит и взаимодействует с дезоксигемоглобином:

NO₂^– + дезоксиHb (Fe²⁺) + Н⁺ → MetHb (Fe³⁺) + NO +ОН^–.

Образующийся в ходе нитритредуктазной реакции NO может оказать дистантные регуляторные эффекты и имеет важное значение в нитрит-зависимой вазодилятации при гипоксии.

Принцип метода. Определение основано на восстановлении нитратов металлическим кадмием до NO₂^–:

NO₃^– + Cd + H₂O = NO₂^– + 2OH^– + Cd²⁺

и последующим определением образующихся нитритов по цветной реакции с реактивом Грисса.

Реактивы и их приготовление.

1. 50 % раствор сульфата цинка.

2. 17 % раствор феррицианида калия.

3. Аммиачный буфер. 50 мл концентрированной соляной кислоты (плотность 1,19 г/см³) + 600 мл дистиллированной воды + 135 мл концентрированного водного аммиака (плотность 0,9 г/см³). После проверки pH (рH 9,6–9,7) объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

4. 0.1 н. соляная кислота.

5. Раствор сульфаниламида. В колбу емкостью на 250 мл помещают 0,1 г сульфаниламида + 200 мл дистиллированной воды + 10 мл концентрированной соляной кислоты. Выдерживают в кипящей водяной бане до полного растворения осадка (раствор хранят не более 2-х недель).

6. Раствор N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорида (НЭДа). 0,1 г НЭДа растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в дистиллированой воде и доводят объем раствора до метки (раствор хранят не более 2-х недель).

7. 5 М соляная кислота.

Приготовление губчатого кадмия. Цинковые гранулы средней величины (100–120 шт.) распределяют по дну кристаллизатора диаметром от 25 до 30 см и заливают раствором серно-кислого кадмия (37 г сернокислого кадмия растворяют в воде и разбавляют водой до 1000 мл). Через 3–4 ч осадок кадмия отделяют от цинка и помещают в стакан с водой, избегая соприкосновения с воздухом, и дважды промывают водой. Осадок кадмия и 400 мл раствора помещают в гомогенизатор и измельчают в течение 10 с. Измельченный кадмий переносят в стакан и отмывают водой от пылевидных частиц. После этого его оставляют на ночь в 0,1 н. растворе НСl, перемешивают несколько раз для удаления всех пузырьков газа из кадмия. Кадмий необходимо хранить под слоем воды.

Омеднение кадмия. 120 г кадмия помещают в стакан емкостью на 1 л, промывают 300 мл 0,1 н. соляной кислоты, затем дистиллированной водой и заливают 500 мл раствора сульфата меди (10 г сульфата меди растворяют в 500 мл дистиллированной воды). Перемешивают до почти полного обесцвечивания раствора сульфата меди (до появления черных мелкодисперсных частиц). После омеднения кадмий тщательно отмывают дистиллированной водой от мелких частиц, не осаждающихся в течение 2–3 с после интенсивного перемешивания кристаллов омеднённого кадмия в стакане с водой.

Рис. 4. Установка для восстановления нитратов: 1 – стеклянная кадмиевая колонка; 2 – соединение на шлифе или резиновая пробка; 3 – сборник; 4 – стеклянная трубка; 5 – резиновая соединительная трубка; 6 – кран; 7 – стеклянная вата

Подготовка кадмиевой колонки к работе. Собирают установку согласно рис. 4. На дно стеклянной колонки помещают тонкий слой стеклянной ваты, колонку заполняют водой и вносят суспензию кадмия фарфоровой ложкой на высоту 13–15 см. При заполнении колонки дают воде периодически стекать, следя, чтобы уровень воды не опускался ниже поверхности кадмия. Поверхность кадмия в колонке должна быть всегда покрыта жидкостью.

Регенерирование кадмиевой колонки. Перед началом работы и после каждого анализа кадмиевую колонку промывают последовательно 25 мл 0,1 н. соляной кислоты, 50 мл дистиллированной воды и 25 мл аммиачного буфера, разбавленного в 10 раз. Уровень жидкости всегда должен быть выше слоя кадмия.

Проверка восстановительной способности кадмиевой колонки

а) Восстановительную способность кадмиевой колонки проверяют каждый раз перед проведением серии анализов.

При закрытом кране в сборник колонки пипеткой вносят 20 мл рабочего раствора азотнокислого калия и 5 мл аммиачного буферного раствора. Устанавливают скорость элюции 3–5 мл/мин и собирают элюат в мерную колбу вместимостью 100 мл. Когда сборник опустеет, стенки его дважды смывают водой порциями по 15 мл, и воду также пропускают через слой кадмия. Собирают около 100 мл элюата, доводят объем до метки водой и перемешивают.

б) Проводят контрольное определение, повторяя операцию, как указано выше, используя 20 мл воды вместо раствора азотнокислого калия.

в) В две мерные колбы вместимостью 50 мл вносят пипеткой в одну 10 мл испытуемого элюата, в другую 10 мл контрольного элюата и далее проводят определение с реактивом НЭДа, как описано ниже.

Если содержание нитрит-иона, найденного по градуировочному графику, менее 0,27 мкг в 1 мл измеряемого раствора (менее 90 % расчетного значения), колонку переподготавливают. Для этого из колонки пористый кадмий переносят в стакан, содержащий раствор 2 н. HCl, выдерживают 10 мин, промывают несколько раз водой, заполняют колонку и снова определяют восстановительную способность кадмиевой колонки.

Построение градуировочного графика для определения нитрат/нитрит ионов

Реактивы и их приготовление.

1. Основной стандартный раствор нитратов. 1,630 г калия азотнокислого (высушенного при t = 110–120^○C до постоянной массы) помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в дистиллированной воде и доводят водой до метки (хранят в темной посуде не более 6 месяцев).

2. Рабочий раствор нитратов. 10 мл основного стандартного раствора нитратов в колбе вместимостью 1 л доводят дистиллированной водой до метки. 1 мл этого раствора содержит 10 мкг NO₃^– (хранят 1 месяц).

Ход определения. Построение калибровочной кривой. В мерные колбы вместимостью 25 мл вносят 0 (контрольный раствор), 1, 2, 4, 8, 10 мл рабочего раствора нитратов, доводят до объема 20 мл дистиллированной водой, 5 мл аммиачного буфера и перемешивают.

Через предварительно промытую кадмиевую колонку пропускают со скоростью 3–5 мл/мин сначала один из полученных растворов нитратов, затем 25 мл дистиллированной воды, собирают элюат в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем до метки.

После того, как один из растворов нитратов пропущен через колонку, собран в колбу (50 мл) и доведен до метки дистиллированной водой, 25 мл полученного элюата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и проводят цветную реакцию (т. е. последовательно добавляют 5 мл раствора сульфаниламида, 1 мл 5 М раствора соляной кислоты, перемешивают и оставляют на 5 мин, а затем добавляют 1 мл раствора НЭДа). Объем пробы доводят до метки дистиллированной водой и через 10 мин определяют оптическую плотность в кюветах толщиной 1 см при длине волны 538 нм по отношению к контрольному раствору.

По полученным данным строят градуировочный график, откладывая по оси ординат значение оптической плотности, а по оси абсцисс значения концентрации нитрат/нитрит-иона: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 и 1,0 мкг/мл.

Ход анализа. В центрифужные пробирки вместимостью 10 мл помещают 1 мл 50 % раствора сульфата цинка и 1 мл 17 % раствора феррицианида калия (K₄Fe(CN)₆), 1 мл плазмы крови. Затем прибавляют 2 мл аммиачного буфера и 5 мл дистиллированной воды. Полученную смесь перемешивают и центрифугируют в течение 20 мин при 2500 об./мин. Параллельно проводят холостой опыт.

При осаждении белков важно соблюдать необходимое значение pH во избежание получения мутного фильтрата, появляющегося при pH менее 8,5 при пропускании исследуемого раствора через колонку. Образующийся осадок затрудняет работу колонки. Поэтому при pH менее 8,5 необходимо добавлять 30 % раствор NaOH.

Отбирают аликвоту центрифугата объемом 5 мл в центрифужную пробирку на 10 мл, прибавляют 2,5 мл аммиачно-хлоридного буфера, 2,5 мл дистиллированной воды, перемешивают и пропускают через колонку с губчатым кадмием вначале холостую пробу, затем испытуемые.

После того как пройдет первая порция (10 мл испытуемого раствора) в те же пробирки заливают 10 мл дистиллированной воды, ополаскивают и вновь пропускают через колонку. И так 3 раза.

Весь элюат собирают в колбу на 50 мл, не доводя объём раствора в колбе до метки примерно на 10 мл. Затем проводят цветную реакцию.

Концентрацию нитрат/нитрит ионов определяют по градуировочному графику. Оптическую пробу определяют против нулевого (холостая проба) раствора.

Содержание нитрат/нитрит-ионов в анализируемых образцах рассчитывают по формуле:

,

где С₁ – концентрация нитрат/нитрит-ионов в фотометрируемом растворе, найденная по градуировочному графику (в мкг/мл); V₁ – общий объем безбелкового экстракта (мл); V₂ – общий объем фотометрируемого раствора (мл); V₃ – объем образца, взятый для анализа (мл); V₄ – объем безбелкового экстракта, взятый для дальнейшего анализа (мл).

Для полного восстановления кадмия периодически (после шестикратного использования кадмиевой колонки) извлекают его из колонки и оставляют на ночь в 0,1 н. соляной кислоте. Перед тем как его внести обратно в колонку вновь проводят омеднение.

Литература

1. Бондаренко О.Н., Бондаренко Н.А., Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Антистрессорный эффект оксида азота // Изв. АН. Сер. биологическая. – 2001. – № 4. – С. 459–466.

2. Емченко Е.А., Цыганенко О.И., Ковалевская Т.В. Универсальный метод определения нитратов в биосредах организма // Клинич. лаб. диагностика. – 1994. – № 6. – С. 19–20.

3.3. Определение активности ксантиноксидазы

Наряду с лейкоцитами, обладающими специализированным генератором супероксидного радикала, источником массированной продукции О₂ может выступать и ксантиноксидаза (КФ: 1.2.3.2). В тканях организма (преимущественно на эндотелиальных клетках) этот белок представлен в основном в форме мембранносвязанной ксантиндегидрогеназы (КФ: 1.2.1.37), катализирующей превращение гипоксантина и ксантина в мочевую кислоту:

Гипоксантин + Н₂О + НАД⁺ → Ксантин + НАДН + H⁺

Ксантин + Н₂О + НАД ⁺ → Урат + НАДН + H⁺.

Причем механизмы действия этих двух функциональных форм фермента принципиально различаются. И лишь около 10 % от суммарного содержания этого белка на эндотелии находится в трансформированной оксидазной форме, использующей в качестве акцептора электронов не пиридиннуклеотид, а молекулярный кислород:

Гипоксантин + Н₂О + 2О₂ → Ксантин + 2О₂ + 2H⁺

Ксантин + Н₂О + 2О₂ → Урат + 2О₂ + 2Н⁺.

Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа обеспечивают утилизацию всего «лишнего» ксантина, который при недостаточной утилизации способен вызывать миалгии и инфаркты почек.

Ксантиноксидаза и ксантиндегидрогеназа присутствуют практически во всех тканях животного организма. Наивысшей удельной активностью эти две функциональные формы обладают в печени, в цитозоле гепатоцитов, Купферовских клеток и эндотелиальных клеток. После печени по количеству ксантиноксидазы (ксантиндегидрогеназы) следуют слизистая оболочка тонкого кишечника, а затем почки и головной мозг, однако в данных органах удельная активность ксантиноксидазы довольно низка.

В условиях окислительного стресса происходит ускоренная конверсия ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу. Пусковым механизмом этого процесса является Са-зависимый протеолиз. Установлено также, что трансформация ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу может осуществляться и с помощью принципиально обратимого процесса: окислением SH-групп этого фермента до дисульфидов. В результате такой трансформации характер катализируемой реакции изменяется, и одновременно с мочевой кислотой начинает образовываться супероксид-анион кислорода. В результате этого в клетках происходит дополнительное увеличение концентрации свободных радикалов.

3.3.1. Определение активности ксантиноксидазы в печени

Принцип метода. Метод определения активности ксантиноксидазы основан на способности фермента при преобразовании ксантина в мочевую кислоту генерировать супероксид-анион радикал, о содержании которого можно судить по скорости восстановления нитросинего тетразолия в окрашенный продукт – формазан, имеющий максимум поглощения при длине волны 540 нм.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,05 М натрий-фосфатный буфер с 1 мМ ЭДТА, рН 7,8.

2. Субстратная смесь: к 100 мл буфера добавляют 680 мкг (50 мкМ) гипоксантина, 460 мкг (15 мкМ) феназинмета-сульфата, 5,71 мг (420 мкМ) нитросинего тетразолия, 140 мг желатина. Раствор готовят перед исследованием либо хранят в замороженном виде.

Ход определения. 3 мл субстратной смеси прогревают в течение 5 мин в кювете спектрофотометра при температуре 37°С. Реакцию запускают добавлением 100 мкл цитозольной фракции ткани печени, полученной при дифференциальном центрифугировании. Регистрируют скорость увеличения оптической плотности пробы в течение 10 мин при длине волны 540 нм и температуре инкубации 37 °С в кювете с длиной оптического пути 10 мм против инкубационной среды равного объема, куда вместо пробы добавляют дистиллированную воду.

Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции формазана, равного 7,2·10³ М^–1см^–1.

3.3.2. Определение активности ксантиноксидазы в плазме крови

Можно определять активность ксантиноксидазы в плазме крови по уровню образовавшейся в результате реакции мочевой кислоты.

Реактивы и их приготовление. Реакционная смесь: 100 мкл (50 мкМ) ксантина, 100 мкл (500 мкМ) НАД⁺ или буфер без НАД⁺, 600 мкл (0,0024 М) К-фосфатного буфера, 0,15 М NaCl, рН 7,35. Реакционная смесь содержит также ингибитор уриказы (2,4-гидрокси-6-карбокси-1,3,5-триазин) в конечной концентрации 3 мкМ.

Ход определения. К указанному объему реакционной смеси добавляют 100 мкл плазмы крови. Инкубация в течение 30 мин при температуре 37 °С. Уровень образовавшейся мочевой кислоты определяют спектрофотометрически при λ = 293 нм.

Для расчета строят калибровочную кривую по мочевой кислоте или используют коэффициент молярной экстинкции 7,59·10³ М^–1см^–1.

Результаты выражают в нмоль мочевой кислоты на мл плазмы в мин.

Литература

1. Медицинские лабораторные технологии / под ред. Л.И. Карпищенко. – СПб.: Интермедика, 1999. – Т. 2. – С. 33–34.

2. Waud W.R., Rajagopalan К.V. Purification and properties of the NAD⁺-dependent (type D) and О₂ dependent (type O) forms of rat liver xantine dehydrogenase // Arch. Biochem. Biophys. – 1976. – Vol. 172. – P. 354–364.