Глава 2. Методы подготовки биологического материала

2.1. Получение сыворотки крови

Крыс забивают декапитацией. Кровь собирают в центрифужные пробирки. Для лучшей ретракции тромба пробирки с кровью выдерживают при 37 °С в течение 30 мин. Сыворотку отделяют центрифугированием образцов при 3000 об./мин в течение 15 мин и сразу же используют для анализа.

2.2. Получение плазмы крови

Крыс забивают декапитацией. Кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином (200 ед./мл) и центрифугируют при 1500 об./мин (800 g) в течение 10 мин. Плазму осторожно отбирают и хранят на холоде для дальнейшего использования.

2.3. Получение гемолизата

Кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином (200 ед./мл) и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Плазму отбирают, а эритроциты трижды отмывают холодным физиологическим раствором, каждый раз центрифугируя при тех же оборотах в течение 5 мин. Отмытые эритроциты гемолизируют, для чего к 0,3 мл упакованных эритроцитов с помощью пипетки сильной струей приливают 2,7 мл охлажденной бидистиллированной воды. Гемолизат периодически встряхивают в течение 5 мин, а затем центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин для осаждения стромы и неразрушенных клеток. Прозрачный гемолизат сливают в стоящую на льду пробирку и используют в дальнейшей работе.

2.4. Выделение мембран эритроцитов

Принцип метода. Эритроциты после гипоосмотического гемолиза отмывают от гемоглобина многократным их промыванием буферным раствором с низкой ионной силой.

Отбор проб и их хранение. Смешанную артериальную и венозную кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином (200 ед./мл).

Оборудование. Скоростная центрифуга с охлаждением типа К-24.

Реактивы и их приготовление.

1. Гемолизирующий буфер. 0,01 М трис-HCl буфер (рН 7,8 при 20 °С). В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют в дистиллированной воде 605,7 мг триса, рН доводят 1 н. HCl, объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

2. Отмывающий буфер. 0,01 М трис-HCl буфер (рН 7,8 при 20 °С), содержащий 1,5 мМ ЭДТА. В мерной колбе на 500 мл растворяют в дистиллированной воде 605,7 мг триса и 279,2 мг ЭДТА, рН доводят до необходимого значения 1 н. HCl; объем раствора доводят до метки дистиллированной водой.

3. 0,145 М хлорид натрия, приготовленный на 0,01 М трис-HCl буфере.

Ход работы. Для осаждения эритроцитов собранную кровь центрифугируют при 1500 об./мин в течение 10 мин. Плазму удаляют, а верхний слой эритроцитов, содержащий лейкоциты, осторожно собирают на фильтровальную бумагу и отбрасывают. Затем эритроциты 3 раза промывают охлажденным физиологическим раствором, каждый раз осаждая клетки при 1500 об./мин в течение 10 мин, удаляя верхний слой эритроцитов фильтровальной бумагой. Один объем отмытых эритроцитов быстро и энергично смешивают с 20 объемами охлажденной до 4 °С гемолизирующей среды и выдерживают при этой температуре в течение 5 мин.

Гемолизат фильтруют через нейлоновый фильтр, а затем центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок теней промывают 5 раз 0,01 М трис-HCl буфером, каждый раз осаждая их при 14000 об./мин в течение 20 мин. Конечный осадок «белых» теней суспендируют в подходящей среде и используют в опыте, либо замораживают и хранят при –20 °С.

Литература

Казенов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Исследование активности АТФазы в эритроцитах млекопитающих // Биохимия. – 1984. – Т. 49, № 7. – С. 1089–1095.

2.5. Методика выделения синаптосом

Принцип метода. Субклеточные частицы, нанесенные на градиент сахарозы, под действием центробежного ускорения двигаются до зоны, соответствующей их плавучей плотности.

Отбор проб и их хранение. Крыс забивают декапитацией. Вскрывают череп и быстро извлекают головной мозг. Мозг переносят в холодный физиологический раствор. Через несколько минут его обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от сосудистых оболочек. На холоде отделяют кору больших полушарий головного мозга и сразу же используют в работе.

Оборудование: центрифуга с охлаждением, магнитная мешалка, стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

2. 0,32 М раствор сахарозы.

3. 0,32 М раствор сахарозы, приготовленный на 0,01 М трис-HCl буфере (рН 7,4), содержащий 1 мМ ЭДТА (среда гомогенизации).

4. 0,8 М раствор сахарозы.

5. 0,15 М раствор сахарозы.

Все растворы сахарозы готовят перед опытом.

Ход определения. 1 г коры больших полушарий мозга измельчают холодным скальпелем, а затем переносят в стеклянный гомогенизатор. Туда же добавляют 5 мл среды гомогенизации (0,32 М сахароза на 0,01 М трис-HCl-буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА). С помощью тефлонового пестика мозг гомогенизируют вручную. Затем гомогенизацию продолжают с помощью электромотора (1000 об./мин), делая 10 проходов вверх и вниз и после минутного перерыва еще столько же раз. Во избежание образования пены при гомогенизации нельзя допустить выхода пестика из гомогената. После гомогенизации доливают необходимое количество среды гомогенизации для получения 10 %-ного (1 г ткани + 9 мл среды гомогенизации) гомогената.

Полученный гомогенат центрифугируют при 800 g в течение 10 мин для осаждения неразрушенных кусочков ткани, кровеносных сосудов, ядер клеток. Супернатант сливают в стоящую во льду пробирку. К осадку добавляют среду выделения до прежнего объема и после суспендирования с помощью пипетки с узким носиком вновь центрифугируют при тех же условиях. Объединенные супернатанты разливают в две пробирки (приблизительно по 7 мл) и центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин. Супернатант сливают. Осадок представляет собой «грубую» митохондриальную фракцию, в которую входят митохондрии, синаптосомы, миелин. В каждой пробирке полученные осадки суспендируют в 1 мл 0,32 М сахарозы, а затем их объединяют. 2 мл суспензии «грубых» митохондрий наносят на 7 мл 0,8 М сахарозы и центрифугируют при 10000 g в течение 25 мин. После центрифугирования фракции распределяются следующим образом (рис. 2):

а) белый слой миелина на границе 0,3–0,8 М сахарозы;

б) легкие синаптосомы – частицы, взвешенные по всему объему 0,8 М сахарозы;

в) митохондрии и тяжелые синаптосомы.

Сначала отбирают фракцию миелина и тщательно вытирают фильтровальной бумагой стенки пробирки. Затем осторожно сливают в стоящий во льду бюкс фракцию синаптосом и разбавляют их до концентрации сахарозы 0,3–0,35 М. Для этого отобранную фракцию синаптосом на магнитной мешалке осторожно, во избежание шока, разводят холодной 0,15 М сахарозой. Синаптосомы осаждают при 14000 об./мин в течение 25 мин.

Литература

Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. – 1975. – V. 93, № 3. – P. 485–489.

2.6. Определение гемоглобина в крови аммиачным методом

Принцип метода. В результате гемолиза эритроцитов разведенным раствором аммиака образуется оксигемоглобин, отличающийся сравнительно стойкой окраской. По результатам анализа значений оптической плотности судят о его концентрации.

Отбор проб и их хранение. Кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином (200 ед./мл) и сразу же используют в работе.

Оборудование: центрифуга с охлаждением, фотоколориметр КФК-2, КФК-3 и др.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,04 %-ный раствор аммиака. Его готовят из 25 %-ного концентрированного (плотность – 0,91 г/мл) раствора аммиака, к 1,6 мл которого приливают дистиллированную воду до объема 100 мл.

2. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Ход определения. Кровь центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Отбирают плазму, а эритроциты отмывают холодным физиологическим раствором три раза, каждый раз центрифугируя при тех же оборотах в течение 5 мин. Полученные отмытые эритроциты гемолизируют в пробирках на холоде. Для этого к 0,3 мл эритроцитов с помощью пипетки сильной струей приливают 2,7 мл охлажденной бидистиллированной воды. Суспензию периодически встряхивают в течение 5 мин. Затем центрифугируют при 14000 об./мин в течение 20 мин для осаждения стромы и неразрушенных клеток.

Для определения содержания общего гемоглобина к 4,9 мл 0,04 %-ного раствора аммиака прибавляют 0,1 мл полученного гемолизата. Оптическую плотность раствора измеряют при длине волны 540 нм в кювете на 5 мм. Содержание гемоглобина рассчитывают по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика на гемоглобин. Из крови крыс готовят раствор гемоглобина, используя один из методов, описанных ниже. В ней определяют концентрацию гемоглобина с помощью тест-набора гемиглобинцианидным методом. Затем раствор гемоглобина с точно установленной концентрацией разбавляют водой таким образом, чтобы в 0,1 мл находилось от 1 до 10 мг гемоглобина. К каждой пробе добавляют 4,9 мл 0,04 %-ного раствора аммиака и через 10 мин фотометрируют при длине волны 540 нм в кювете со слоем жидкости 5 мм. По полученным данным строят график зависимости экстинкции от концентрации гемоглобина.

Приготовление раствора гемоглобина.

Первый метод. Собранную кровь (3–4 мл) центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин. Плазму и верхний слой эритроцитов удаляют. Эритроциты трижды отмывают 0,9 %-ным раствором хлорида натрия и последующим центрифугированием. К полученной эритроцитарной массе в равном объеме добавляют дистиллированную воду и 0,4 объема четыреххлористого углерода (хлороформ). Пробирку закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10 мин. После этого пробирку оставляют на 1 ч в холодильнике. Затем образец центрифугируют при 10000 об./мин в течение 30 мин, либо при 4000–5000 об./мин в течение 1 ч. Гемолизат осторожно отбирают (под ним остается довольно плотный слой стромы, а внизу – четыреххлористый углерод).

Второй метод. Эритроциты, после удаления плазмы, трижды отмывают 0,9 %-ным раствором хлорида натрия, центрифугируя каждый раз при 3000 об./мин в течение 10 мин. К отмытым эритроцитам добавляют 2 объема дистиллированной воды, и в течение 15–18 ч при 3–4 °С проводят гемолиз. Раствор гемоглобина отделяют от стромы эритроцитов центрифугированием при 10000–12000 об./мин в течение 20 мин.

Концентрацию гемоглобина в растворе, полученном как первым, так и вторым методами, устанавливают гемиглобинцианидным методом, используя стандартные наборы.

Литература

Лопатина Н.И., Геронимус А.Л., Тренестова Е.П. Определение фетального гемоглобина в крови при помощи ФЭКа // Лаб. дело. – 1976. – № 6. – С. 328–331.

2.7. Определение содержания гемоглобина в гемолизате

цианметгемоглобиновым методом

Принцип метода. Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина.

Оборудование: фотоэлектроколориметр.

Реактивы и их приготовление.

1. Ацетонциангидрин (2 ампулы по 0,5 мл – 0,47 г).

2. Калий железосинеродистый (2 флакона по 200 мг).

3. Натрий бикарбонат (2 флакона по 1 г).

4. Стандартный раствор гемиглобинцианида. Концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе производства фирмы «Реанал» (Венгрия) составляет 597,5 г/л (59,75 %), что соответствует 150 г/л гемоглобина при разведении крови 251 раз (15 г %). Стандартный раствор хранят в холодильнике при 4 °С, в защищенном от света месте (предохранить от замораживания).

5. Трансформирующий раствор. Содержимое трех флаконов – 1, 2 и 3, количественно переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1 л. Раствор стабилен при хранении в склянке из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При появлении осадка или обесцвечивании раствор непригоден для употребления.

Ход определения. 0,02 мл гемолизата приливают к 5 мл трансформирующего раствора в пробирке (разведение в 251 раз) и хорошо перемешивают. Через 10 мин измеряют оптическую плотность на фотоколориметре при длине волны 500–600 нм в кювете с толщиной слоя жидкости 10 мм против холостой пробы (трансформирующий раствор). При тех же условиях измеряют и стандартный раствор.

Концентрацию гемоглобина рассчитывают по формуле:

,

где X – концентрация гемоглобина, г/л (г %); E_о и E_ст – экстинкция опытной пробы и стандартного раствора; С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, г/л (г %); К – коэффициент разведения крови; 0,001 – коэффициент пересчета.

2.8. Количественное определение белка методом Лоури

Принцип метода. Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот (триптофан и тирозин) с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Высокая чувствительность метода дает возможность определять 10–100 мкг белка в пробе. Однако по сравнению с методами, основанными на биуретовой реакции, метод Лоури менее специфичен, так как интенсивность окрашивания зависит от аминокислотного состава белка.

Оборудование: фотоколориметр.

Реактивы и их приготовление.

1. 2 %-ный раствор карбоната натрия, приготовленный на 0,1 н. натриевой щелочи.

2. 0,5 %-ный раствор сернокислой меди, приготовленный на 1 %-ном растворе цитрата натрия.

3. Рабочий раствор: 1 мл раствора 2 смешивают с 50 мл раствора 1. Готовится непосредственно перед употреблением.

4. Реактив Фолина – Чикальтеу. В круглодонную колбу на 1 л наливают 350 мл дистиллированной воды. Добавляют 50 г вольфрамата натрия (NaWO₂·2H₂O), 12,5 г молибдата натрия (NaМоO₂·2H₂O) и перемешивают до полного растворения. К полученному раствору приливают 25 мл 85 %-ного раствора фосфорной кислоты, 50 мл концентрированной соляной кислоты и смесь кипятят с обратным холодильником 10 ч. Затем добавляют 75 г сернокислого лития, 25 мл дистиллированной воды и 3 капли брома. Кипятят, но уже без холодильника, в течение 15 мин под тягой для удаления избытка брома. Охлаждают до комнатной температуры, и дистиллированной водой общий объем доводят до 500 мл. Перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 1 мл, разводят 10 раз дистиллированной водой и титруют 0,1 н. раствором натриевой щелочи по фенолфталеину. После этого ко всему объему добавляют такое количество дистиллированной воды, чтобы получить конечную концентрацию кислоты в растворе, равную 1 н. Хранят в темной склянке с притертой пробкой. Может храниться длительное время.

5. 0,1 н. и 1 н. растворы натриевой щелочи.

6. 1 %-ный раствор дезоксихолата натрия.

7. 10 % и 2 %-ный растворы трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

Ход определения. Исследуемый раствор, содержащий до 100 мкг белка, доводят дистиллированной водой до 0,4 мл. (При определении белка в мембранной фракции их предварительно нужно солюбилизировать 1 %-ном раствором дезоксихолата натрия или 0,1 н. раствором натриевой щелочи и рекомендуется доводить объем пробы до 0,4 мл этими детергентами). Смешивают с 2 мл рабочего раствора (3), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина – Чикальтеу. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и через 30 мин колориметрируют при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя жидкости 5 мм. Предварительно строят калибровочный график по стандартному раствору белка. По калибровочному графику определяют содержание белка в опытной пробе.

В случае предварительного осаждения белка к исследуемому раствору добавляют ТХУ из такого расчета, чтобы конечная концентрация ее была 3–5 %. Раствор тщательно перемешивают и оставляют на 10–20 мин. Выпавший осадок белка отделяют центрифугированием (6000 об./мин, 10 мин), а затем промывают 2 %-ным раствором ТХУ. К осадку добавляют 1–2 мл 1 н. раствора натриевой щелочи и осторожно подогревают до растворения осадка белка. Раствор белка переносят в мерную колбу на 25–50 мл, доводят до метки, тщательно перемешивают и проводят определение белка.

Построение калибровочного графика на белок. Готовят стандартный раствор белка. Для этого 10 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в небольшом количестве (2–3 мл) 0,1 н. натриевой щелочи и объем доводят до 50 мл этой же щелочью. В 1 мл этого раствора содержится 200 мкг белка. Состав проб для определения белка в стандартных растворах приведен в табл. 2.

Таблица 2. Схема смешивания реактивов для определения содержания белка по методу Лоури

№ пробирки	Стандартный раствор, мл	Белок, мкг	0,1 н. раствор натриевой щелочи	Примечание
1 2 3 4 5 Контроль	0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 -	10 20 40 60 80 -	0,35 0,3 0,2 0,1 - 0,4	В каждую пробирку добавляют 2 мл рабочего раствора и через 10 мин 0,2 мл реактива Фолина. Пробы выдерживают при комнатной температуре 30–40 мин и фотометрируют при длине волны 750 нм против контрольной пробы.

По результатам колориметрирования строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс количество белка в пробирке, а на оси ординат – оптическую плотность.

Литература

Lowry D.H., Rosebrough H.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 193, № 1. – P. 265–275.

2.9. Определение белка в плазме крови биуретовым методом

Принцип метода. Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди в щелочной среде.

Реактивы и их приготовление.

1. Стандартный раствор белка, например, сывороточного альбумина, содержащий 10 мг в 1 мл 0,9 % раствора NaCl.

2. Биуретовый реактив: 0,15 г CuSO₄×5H₂О и 0,6 г NаКС₄Н₄О₆×4Н₂О (виннокислый натрий-калий или сегнетова соль) растворяют в 50 мл Н₂О при энергичном перемешивании, приливают туда 30 мл 10 %-ного раствора NаОН (свободного от Nа₂СО₃), добавляют 0,1 г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления и раствор доводят водой до 100 мл. Хранят в парафинированной или полиэтиленовой склянке.

3. 0,9 % раствор NaCl.

Ход определения. К 1 мл разведённой в 10 раз плазмы добавляют 4 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Через 30 мин определяют оптическую плотность проб при длине волны 540 нм в кюветах толщиной 10 мм против контроля. В контрольную пробу вместо исследуемого материала добавляют 1 мл дистиллированной воды. Содержание белка в пробе в мг находят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Калибровочный график строят по стандартному раствору альбумина (10 мг белка в 1 мл), используя следующую схему:

Схема разведения стандартного раствора альбумина

№	Стандартный раствор альбумина, мл	Физраствор, мл	Количество альбумина, мг	Примечание
1	0,2	0,8	2	Во все пробы добавить 4 мл биуретового реактива и через 30 мин колориметрировать при длине волны 540 нм против контрольной пробы.
2	0,4	0,6	4
3	0,6	0,8	6
4	0,8	0,9	8
5	1,0	-	10
Контроль	-	1,0	-

Полученные результаты используют для построения калибровочного графика.

Литература

Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358 с.