Глава 1. Активные формы кислорода и их роль в норме

и в условиях оксидативного стресса

Процессы метаболизма кислорода в организме связаны с образованием АФК, обладающих выраженной реакционной способностью. «Активные формы кислорода» – это понятие собирательное, объединяющее такие соединения, как молекулы – перекись водорода (Н₂О₂), озон (О₃) и синглетный кислород (¹О₂), гипохлорит (HOCI); ионы – НО₂^–, пероксинитрит (ONOO^–); свободные радикалы – супероксидный (О₂), гидроксильный (НО^•), пергидроксильный (НО₂^•), пероксильный (RO₂^•), алкоксильный (RО^•) и оксид азота (NО^•). Электронные структуры некоторых из этих АФК приведены на рис. 1.

Рис. 1. Электронные структуры некоторых активных форм кислорода;

_* – неспаренный электрон

Общим для всех этих соединений является их высокая реакционная способность. АФК отличаются друг от друга реакционной способностью, временем жизни и выполняемыми функциями (табл. 1).

АФК образуются в результате нормально протекающих процессов в организме и выполняют определенную биологическую функцию. Свободнорадикальное окисление – неотъемлемое звено таких важных биологических процессов, как транспорт электронов в дыхательной цепи, синтез простагландинов и лейкотриенов, пролиферация и дифференциация клеток, метаболизм и синтез катехоламинов, фагоцитоз, метаболизм разных ксенобиотиков. В нормально функционирующем организме они участвуют в метаболизме структурных компонентов клеточных мембран (белков, липидов, углеводов) и соответственно регулируют не только скорость их метаболизма, но и функциональное состояние самой мембраны клетки. С особенностями метаболизма АФК связывают изменение мембранной подвижности, текучести, деполяризацию мембран.

Таблица 1. Основные виды АФК (Беленичев и др., 2009)

Вид АФК	Хим. символ	Время полужизни при T 37 ºC, c	Свойства
Супероксид-радикал	О2	10^–6	Хороший восстановитель, умеренный окислитель. Обладает свойствами внутриклеточного мессенджера: сигнальный механизм при взаимодействии различных подтипов глутаматных и аспартатных рецепторов, регуляция активности хлорных каналов, индукция образования пор в митохондриальной мембране. Участвует в окислительной модификации SН- и NН2-групп низкомолекулярных соединений. Вазоконстриктор. Антисептик
Гидроксил-радикал	НО^•	10^–9	Мощный окислитель. Чрезвычайно активен в реакциях акцептирования и переноса электронов. Участвует в окислительной модификации нуклеиновых кислот, белков, липидов, простагландинов. Диффундирует на очень малые расстояния
Перекись водорода	Н2О2	10–100	Оксидант, характеризуется малыми скоростями взаимодействия с органическими субстратами. Обладает высокой диффузной способностью. Обладает свойствами мессенджера: активация факторов транскрипции NF-κB, АР-1, редокс-регуляция экспрессии генов
Синглетный кислород	^1О2	10^–6	Мощный окислитель
Пероксильный радикал	ROO^•	10^–2	Характеризуется низкой окислительной активностью по сравнению с НО^•, но более высокой диффузией. Участвует в регуляции гемодинамики. Вазодилататор
Алкоксильный радикал	RO^•	10^–6	Эффективен при взаимодействии с липидами, приводит к их окислительной модификации. Окислительные свойства на уровне НО^•
Монооксид азота	NO^•	10^–3	Умеренный окислитель, хорошо диффундирует, хороший восстановитель. Обладает свойствами медиатора, вторичного мессенджера или нейромодулятора. Участвует в образовании межнейрональных контактов, экспрессии генов, иммуногенезе, активации гуанилилциклазы. Вазодилататор
Перокси-нитрит	ONOO^–	10^–7	Мощный окислитель. Участвует в реакции нитрования белкового тирозина, окислении SH-групп и металлопротеинов, разрыве цепей ДНK, активирует поли-(АДФ-рибоза)-полимеразу, регулирует уровень внутриклеточного НАД. Характеризуется более низкой, чем у NO^•, но более высокой, чем у НО^•, диффузной способностью
Гипохлорит	OСl^–	10^–6	Мощный окислитель. Характеризуется более высокой, чем у ONOO^–, диффузной способностью, участвует в окислении тиоловых и дисульфидных групп белков и ДНK, хлорировании тирозина. Является редокс-регулятором клеточного сигнала через тирозинкиназу

В физиологических условиях АФК образуются преимущественно в следующих системах [4]:

· в дыхательной цепи митохондрий в небольшом количестве (до 100 пмоль) вследствие «утечки» 1–5 % электронов c физиологических акцепторов на молекулярный кислород (в этом случае генерируется в основном супероксид О₂, скорость образования которого находится в прямой зависимости от степени сопряженности дыхательной цепи); ферментативные комплексы дыхательной цепи митохондрий, которые генерируют О₂ (НАДФ-зависимая дегидрогеназа, НАД-зависимая убихинонредуктаза), могут активироваться при физических нагрузках (мышечное сокращение), энергозависимых процессах в почках, трансмембранных процессах и др.; полагают, что О₂ является родоначальником всех других форм АФК in vivo;

· в процессе активации НАДФН-оксидазы; экспрессия этого фермента характерна для фагоцитирующих клеток крови (нейтрофилы, эозинофилы, макрофаги), эндотелиальных клеток, хондроцитов и астроцитов; НАДФН-оксидаза катализирует одноэлектронное восстановление О₂, принимая восстановительный эквивалент от НАДН или НАДФН; активация НАДФН-оксидазы происходит под действием цитокинов (TNF-γ, TNF-β, IL-1β, некоторые ростовые факторы) и сопровождается образованием О₂ и Н₂О₂;

· при синтезе простагландинов как по циклооксигеназному пути – в процессе превращения PgG₂ в PgН₂ (пероксидазная функция PgН-синтазы), так и по липоксигеназному пути – в процессе превращения гидроперекиси арахидоновой кислоты в оксикислоту; этот процесс контролируется рядом пептидных гормонов (ангиотензин), цитокинов (TNF-β) и ростовых факторов;

· в системе миелопероксидаза-Н₂О₂-галогены (Cl^–, Br^–, I^–), которая запускается вследствие активации фагоцитоза и приводит к образованию О₂, OCl^– и НО^•;

· при спонтанном или катализируемом моноаминоксидазой окислении дофамина и адреналина (при спонтанном окислении образуется О₂, а при катализируемом моноаминоксидазой – Н₂О₂);

· при активации глутаматных рецепторов; так, активация NMDA-подтипа глутаматных рецепторов (ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий N-метил-D-аспартат) на постсинаптической мембране приводит к открытию каналов, проницаемых для Са²⁺ (входящий ток) и К⁺ (выходящий ток); следствием активации этих рецепторов является внутриклеточная продукция АФК (О₂ и НО^•), а результатом активации Са²⁺-зависимой NO-синтазы – NO^•;

· при активации АМРА/каинатных рецепторов, в основе чего лежат как Са²⁺-зависимые, так и митохондриальные механизмы;

· во время синтеза NO^•, образуемого из гуанидинового атома азота и L-аргинина синтазой оксида азота (NOS), которая присоединяет молекулярный кислород к терминальному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина (NOS образует также конечный неактивный продукт – L-цитруллин).

Действие АФК в организме фактически направлено на 3 типа клеточных мишеней: белки, нуклеиновые кислоты и липиды. В норме они активно участвуют в их метаболизме, а при патологических состояниях – в их окислительной деструкции.

Окислительная модификация белков, нуклеиновых кислот, липидов при участии АФК постоянно наблюдается в тканях и играет важную роль в распаде этих соединений. Это один из этапов обновления химического состава тканей.

Пероксидация липидов осуществляется в присутствии металлов переменной валентности и сопровождается образованием группы радикальных продуктов – R^•, RO^•, ROO^•, цитотоксических альдегидов типа 4-гидрокси-2,3-транс-ноненаль или менее токсических, как малоновый диальдегид. Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) носит цепной характер, в нем выделяют фазы инициации, развития цепных реакций и обрыва цепей. Основную роль в обрыве цепных реакций ПОЛ играют компоненты антиоксидантной защиты (АОЗ). В норме содержание радикальных продуктов ПОЛ регулируется за счет действия АОЗ, которая обеспечивает поддержание их на определенном стационарном уровне, обеспечивающем обновление липидов, и в первую очередь липидов мембран, и поддержание структурного гомеостаза. Нарушение этого сбалансированного состояния между процессами ПОЛ и активностью АОЗ приводит к инициированию ПОЛ в биологических мембранах, что сопровождается расстройством функций клеток. Негативные последствия перекисного окисления липидов связаны с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Свободные радикалы липидов способствуют окислительной модификации мембранных белков, ферментов, рецепторов. Наиболее важный результат пероксидации – это уменьшение стабильности липидного слоя. Включение в состав ненасыщенных жирных кислот гидроперекисных группировок повышает их гидрофильность, что приводит к взаимной переориентации жирно-кислотных остатков и объединению их в перекисные кластеры. Появление последних приводит к возникновению новых каналов проводимости вследствие латеральной диффузии молекул в мембране, снижению текучести и повышению жесткости мембран, нарушению белок-липидных взаимодействий, что соответственно ограничивает конформационную подвижность ферментов в ригидном матриксе и приводит чаще всего к снижению их активности. Появление зон с различной вязкостью может сопровождаться концентрированием рецепторов с образованием рецепторных кластеров и полимерных форм рецепторов с измененным сродством к гормонам.

В последнее время большое внимание уделяется изучению роли АФК в процессах метаболизма белков. Белки в силу особенностей своего строения являются одними из основных ловушек АФК. В связи с разнообразием химического строения, особенностями структурной организации белков процесс окислительной модификации белков носит сложный и специфический характер, что сопряжено с образованием большого количества окисленных продуктов радикальной и нерадикальной природы. Окислительное повреждение белков может быть связано с первичным нарушением или самого скелета полипептидной цепи, или отдельных аминокислотных остатков. Разделить эти процессы можно сугубо условно, т. к. окисление полипептидной цепи влечет за собой окисление остатков аминокислот и, наоборот, окислительная модификация радикалов отдельных аминокислот может сопровождаться либо агрегацией, либо фрагментацией белков. Наиболее чувствительными к окислению являются серосодержащие (метионин, цистеин) и ароматические (гистидин, триптофан, тирозин и фенилаланин) аминокислотные остатки белков. Однако селективное повреждение этих лабильных аминокислотных остатков и механизм их окисления зависят от природы АФК.

Окислительная модификация отдельных аминокислотных остатков сопровождается глубокими нарушениями структурной организации белков. Это сопровождается изменением молекулярной массы белков (агрегация или фрагментация), их денатурацией, повышением гидрофобности, снижением изоэлектрической точки, связанной с потерей основных аминокислотных остатков (лизина, аргинина, гистидина), или превращением в результате окисления гистидиновых, пролиновых и цистиновых остатков в аспарагиновые, глутаминовые и цистеиновые, соответственно. Окисление белков приводит к увеличению чувствительности к протеолитическому распаду.

Ответственным за протеолиз окисленных белков является мультикаталитический протеосомный комплекс, который существует в АТФ-независимой 19-20S и АТФ-стимулируемой 26S формах в клетках млекопитающих.

Селективный протеолиз может предотвратить накопление в клетке окисленных белков. В противном случае последние образуют агрегаты в связи с увеличением гидрофобных взаимодействий и дополнительных ковалентных сшивок между молекулами. Скорость оборота внутриклеточных белков зависит от соотношения процессов окислительной модификации белков с последующим их протеолизом и синтезом de novo. В процессе старения организма повышается чувствительность многих белков-ферментов к МКО, и в тканях накапливаются их окисленные неактивные формы.

АФК вызывают окислительную модификацию нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. Это приводит к образованию гидропероксидов ROOH (так, из тимина образуется 5-СН₂ООН-урацил), а затем и гидроксипроизводных ROH или R(OH)₂, основными из которых являются 8-ОН-2'-дезоксигуанозин и тимингликоль (их определение в тканях и моче используют как индексы окислительной модификации ДНК).

Из АФК только НО^• вызывает повреждения ДНК (окисление оснований, их модификации, разрывы цепей, повреждения хромосом), при этом сейчас считают, что АФК вызывают больше мутаций, чем другой класс мутагенов – алкилирующие вещества. Мутации могут привести к патологии и гибели клеток или их злокачественному перерождению (рак, лейкоз и др.), а мутации в ДНК половых клеток – к наследуемым заболеваниям. Высокие концентрации АФК и липидных гидропероксидов ингибируют синтез ДНК и деление клеток и могут активировать апоптоз.

Существует большое количество данных, свидетельствующих о том, что живые организмы не только приспособились к сосуществованию со свободными радикалами, но фактически развили механизмы для выгодного использования их. Об этом свидетельствуют обнаруженные в последнее время новые функции АФК – регуляторные. Имеются определенные экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что действия ряда первичных мессенджеров осуществляются либо через активацию процессов генерации АФК и повышение их уровня в тканях, либо через ингибирование компонентов АОЗ.

Ряд ферментных систем, присутствующих в клетках разных типов, начинает синтез АФК в ответ на действие факторов межклеточной сигнализации. Активация зависимых от Са²⁺ протеаз вызывает протеолитическую трансформацию ксантиндегидрогеназы в продуцирующую О₂ ксантиноксидазу. Образование АФК митохондриями возрастает в клетках под действием интерлейкина-1 и α-фактора некроза опухолей (ФНО-α). Помимо митохондрий основные источники регулируемого синтеза АФК – это расположенные на плазматической мембране НАДФН-оксидазы нефагоцитирующих клеток и 5-липоксигеназа.

Следует отметить, что образование АФК различными изоформами НАДФН-оксидазы играет важную роль в регуляции каскада межклеточной сигнализации в различных типах нефагоцитирующих клеток, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки сосудов, миоциты и клетки тироидной ткани.

Кроме того, установлено, что АФК образуются в клетках, стимулированных цитокинами, такими, как трансформирующий фактор роста р-1 (TGF-J31), интерлейкин-1, ФНО-α; пептидными факторами роста – тромбоцитарный фактор роста PDGF, основной фактор роста фибробластов bFGF (basic fibroblast growth factor); эпидермальный фактор роста EGF (epidermal growth factor); агонистами рецепторов ангиотензина II, тромбина и лизофосфатидной кислоты. Цитокины стимулируют освобождение АФК из многих типов клеток, включая фибробласты, эпителиальные и эндотелиальные клетки.

Это позволяет рассматривать АФК в качестве вторичных мессенджеров, участвующих в передаче сигналов в физиологических условиях за счет регуляции обмена Са²⁺, стимуляции фосфорилирования белков, активации факторов транскрипции.

Ключевое место занимает участие оксидантов в качестве мессенджеров в метаболизме Са²⁺ и процессе фосфорилирования белков. Имеются экспериментальные данные о непосредственном влиянии физиологических концентраций оксидантов (О₂, Н₂О₂, НО^•) на состояние Са²⁺-каналов и насосов, что сопровождается освобождением Са²⁺ из своих клеточных депо или из внеклеточного пространства в цитоплазму клеток. Они увеличивают концентрацию Са²⁺ в цитозоле и тем самым запускают целый каскад реакций, регулируемых Са²⁺. Увеличение мобилизации Са²⁺ из клеточных депо и экстрацеллюлярного пространства не связано с ПОЛ мембран. Предполагают, что действие оксидантов связано с окислением тиолов, которые играют роль в оксидант-опосредованной индукции Са²⁺-сигнала через инозитол-3-фосфатные рецепторы, не влияя на освобождение самого инозитол-3-фосфата. Имеются доказательства ингибирующего влияния АФК на активность АТФ-зависимого Са²⁺-насоса, что приводит к пассивному поступлению Са²⁺ в цитозоль.

Супероксид и перекись водорода участвуют в активации гуанилатциклазы. Образующийся при этом цГМФ модулирует функции протеинкиназ, фосфодиэстераз, ионных каналов и других физиологически важных процессов.

Обнаружено, что О₂ увеличивает активность Са²⁺ и фосфолипидзависимой протеинкиназы С. Действие оксидантов связывают с регуляторным доменом фермента, в состав которого входят тиолы. Избирательная модификация за счет оксидантов некоторых остатков цистеина регуляторного домена приводит к активации фермента.

Другим важным звеном действия оксидантов в передаче сигнальной информации является фосфорилирование белков. Известно, что большая группа белков, включая ферменты, рецепторы, факторы транскрипции, сократительные белки, могут активироваться или инактивироваться за счет фосфорилирования аминокислотных остатков. Уровень фосфорилирования внутри клетки определяется балансом между активностью протеинкиназ и протеинфосфатаз (ПрФаз). Ингибирование ПрФаз за счет Н₂О₂ является одним из физиологических факторов в регуляции протеинкиназ. Показано, что АФК, генерируемые эндогенно при стимуляции рецепторов, ингибируют ПрФазы. Блокада соответствующих рецепторов способствует сохранению активности ПрФаз.

Генерация АФК, приводящая к активации протеинкиназ, сопровождается стимуляцией митоген-активируемых киназ (МАРкиназ). Показано, в частности, что Н₂О₂ участвует в активации МАРкиназ. Сигнальная трансдукция МАРкиназного каскада, включающего киназы 1 и 2, регулируемые внеклеточными сигналами (ERK1/2), в настоящее время рассматривается как один из основных путей действия АФК в качестве мессенджеров.

Известно, что редокс-статус клетки играет важную роль в функционировании многих ферментов, влияя на их активность. Соответственно редокс-статус клетки можно рассматривать в качестве одного из компонентов сигнальных процессов в организме. Одной из основных редокс-чувствительных систем является тиоловая система, и в первую очередь глутатионовая, которая функционирует в виде пары GSН/GSSG. Н₂О₂, снижая уровень GSH, изменяет редокс-статус клетки, выступая в качестве сигнальной молекулы.

Под действием АФК в клетках происходит активация экспрессии редокс-чувствительных генов, многие из которых необходимы для защиты клеток от токсических эффектов окислительного стресса. В настоящее время установлена активация генов глутатионпероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы, гемоксигеназы 1, ферритина, глутатионредуктазы, тиоредоксина, тиоредоксинредуктазы и металлотионеина, а также циклооксигеназы 2 и γ-глутамилцистеинсинтазы. Помимо перечисленных АФК активируют экспрессию генов, действие которых не направлено непосредственно на усиление устойчивости клеток к окислительному стрессу. Эти гены функционально объединяют как отвечающие за клеточные взаимодействия.

Промоторные области индуцируемых под действием АФК генов содержат участки связывания (операторные последовательности) факторов транскрипции АР-1, ATF/CREB, Ets, c/EBP и NF-κB. В отличие от прокариотических факторов транскрипции, содержащих редокс-чувствительные железосерные (SoxR) либо тиоловые рецепторные группы (OxyR), активирующее действие АФК на факторы транскрипции эукариотических организмов опосредовано сложными редокс-чувствительными сигнальными системами. В эти системы входят регуляторные ГТФазы, фосфолипазы, протеинфосфатазы, цГМФ-зависимые, фосфолипидзависимые и MAP-протеинкиназы.

Оксиданты в качестве вторичных мессенджеров активируют некоторые факторы транскрипции, которые связываются со специфическими участками ДНК. Наиболее хорошо изученным является регуляторное влияние АФК на факторы транскрипции Ар-1 (Activator Protein 1) и NF-κB.

Ар-1 состоит из двух субъединиц, одна из которых относится к семейству ДНК-связывающих белков Fos и Jun. Второй субъединицей Ар-1 могут являться белки из семейства факторов транскрипции ATF. Ар-1 контролирует дифференциацию клеток, адаптацию к стрессорным воздействиям, экспрессию клеточных медиаторов роста, включающих гетеродимер fos и jun белков, которые являются белковыми продуктами с-Fos и с-Jun протоонкогенов. Множество различных стимулов, вызывающих окислительный стресс, таких, как относительно низкие концентрации пероксида водорода, УФ-лучи, γ-радиация и интерлейкин-1, различными путями приводят к активации Ар-1.

Индукция матричной РНК Fos и Jun осуществляется относительно низкими концентрациями перекиси водорода, супероксид-анион радикала, NO и другими индукторами окислительного стресса. Окислительная активация транскрипционного фактора Ар-1 связана с окислительной активацией Jun.

Показано, что в процесс активации Ар-1 за счет АФК включается киназа JNR (сериновая MAP-киназа), которая фосфорилирует и активирует факторы транскрипции с-Jun – ATF-2, входящие в состав Ар-1, и способствует индукции фактора ATF-3. Поскольку в промоторной области гена с-Jun расположено несколько участков связывания Ар-1, фосфорилирование и последующая активация фактора с-Jun приводят к индукции его собственного гена. Подобная регуляция активности с-Jun обуславливает продолжительную (несколько часов) активацию факторов транскрипции Ар-1 и устойчивый рост экспрессии подчиненных ему генов в условиях окислительного стресса.

Активация фактора транскрипции NF-κB происходит под действием внеклеточных эффекторов самой разной природы. АФК активируют NF-κB в клетках разных типов, тогда как антиоксиданты подавляют его активность. Фактор NF-κB контролирует экспрессию многих десятков генов, действие которых направлено на повышение устойчивости клеток к стрессовым воздействиям, на подавление апоптоза и регуляцию процессов клеточного иммунитета.

В неактивной форме NF-κB связан с ингибитором 1-κB, который препятствует его перемещению из цитоплазмы в ядро. Большая часть сигналов, приводящих к активации NF-κB, вызывает диссоциацию ингибитора из комплекса с NF-κB. В зависимой от АФК активации NF-κB участвуют разные сигнальные системы клеток. Один из регуляторных путей основан на редоксзависимой активации G-белка p21^Ras, что приводит к активации мембранной фосфатидилинозитол-3-киназы и зависимых от фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата киназы В и С. При накоплении в клетках окисленного тиоредоксина происходит активация NF-κB. В редоксзависимой регуляции NF-κB участвует цитоплазматическая тиоредоксинпероксидаза, которая окисляет тиоредоксин в реакции с Н₂О₂.

Таким образом, АФК играют важную роль в регуляции физиологических функций в тканях, вызывая стимуляцию различных сигнальных трансдукционных процессов, поэтому говорить о токсическом действии АФК не совсем верно. В нормально функционирующем организме АФК следует рассматривать с позиций их биологической значимости. С одной стороны, это продукты нормально протекающих окислительно-восстановительных реакций, с другой – специфические регуляторы метаболических процессов.

Свободнорадикальные реакции свойственны нормально метаболизирующей клетке. Окисление биомолекул идет со значительной скоростью, но стационарная концентрация продуктов окисления довольно мала вследствие наличия сложной системы взаимодействующих путей ее регуляции. Организм обладает многоуровневой стратегией защиты от повреждающего действия АФК. Защита осуществляется путем снижения образования первой АФК – О₂ и функционирования специальной антиоксидантной системы (АОС), выработанной в процессе эволюции аэробных организмов. Основными функциями этой системы являются: ограничение интенсивности реакций свободнорадикального окисления; защита чувствительных к окислительным повреждениям биомолекул мембран, внутри- и внеклеточных структур от действия свободных радикалов и перекисных соединений; восстановление окислительных молекулярных повреждений.

Ключевым ферментом антиокислительной защиты является супероксиддисмутаза (СОД), т. к. при ее участии прерывается цепь свободнорадикальных процессов в начале своего зарождения на стадии одноэлектронного восстановления кислорода с образованием О₂:

СОД

2Н⁺

2 О₂ Н₂О₂ + О₂.

В настоящее время выделено несколько типов СОД: Cu-Zn-содержащая СОД цитозоля клеток эукариотов, Mn-содержащая СОД матрикса митохондрий, Mn-содержащая и Fe-содержащая СОД микроорганизмов. В межклеточном пространстве обнаружена высокомолекулярная внеклеточная (экстрацелюлярная) СОД, обозначаемая как экстра-СОД (ECSOD), состоящая из 4 субъединиц. Этот Cu, Zn-содержащий гликопротеин является главной изоформой межклеточных жидкостей – плазмы, лимфы, синовиальной жидкости и в небольших количествах обнаруживается почти во всех тканях.

Продуктом реакции, катализируемой СОД, является один из компонентов АФК, поэтому очень важно сбалансированное соотношение активностей СОД и пероксидаз, в частности, каталазы и глутатионпероксидазы. Каталаза, гемсодержащий фермент пероксисом клеток, катализирует реакцию расщепления Н₂О₂ при высоких ее концентрациях. Она с громадной скоростью – число оборотов более 10⁷ с^–1, превращает Н₂О₂ в кислород и воду. Поэтому даже в пероксисомах, где перекись водорода непрерывно продуцируется в ходе ферментативных реакций, стационарный уровень Н₂О₂ не превышает 100 нМ, а в цитоплазме он оценивается в диапазоне 10^–7–10^–9 М.

Глутатионпероксидаза (ГПО) эффективно расщепляет не только Н₂О₂, но и гидроперекисные соединения, образовавшиеся при ПОЛ:

2 GSH + Н₂О₂ → 2 GSSG + 2 Н₂О

2 GSH + ROOH → 2 GSSG + ROH + Н₂О.

Роль глутатионпероксидазы в обезвреживании Н₂О₂ в тканях значительно более весома, чем каталазы, так как действие последней ограничено пероксисомами. У ГПО более высокое сродство к Н₂О₂, что определяет ее ведущую роль в метаболизме Н₂О₂ при более низких физиологических концентрациях. В некоторых тканях (мозг, сердце, легкие), где низка активность каталазы, ведущую роль в обезвреживании Н₂О₂ занимает ГПО.

Неферментативное действие АОЗ связано с большой группой низко- и высокомолекулярных химических соединений. К высокомолекулярным соединениям, проявляющим неферментативную антиоксидантную активность, относят церулоплазмин, трансферрин, альбумины плазмы, гистоны, γ-глобулины, гаптоглобин, липопротеины высокой плотности, гепарин и др.

Существует разделение неферментативной АОЗ в зависимости от растворимости ее компонентов. Так, группа жирорастворимых антиоксидантов представлена токоферолами, убихинолами, каротиноидами. К водорастворимым антиоксидантам относят большую группу соединений разного химического строения: аскорбиновая кислота, мочевая кислота, билирубин, восстановленная форма тиолов, некоторые аминокислоты и т. д. При обрыве радикальных цепей низкомолекулярные антиоксидантные соединения могут образовывать радикалы, обладающие разной степенью стабильности и реакционности, что может приводить к спаду антиокислительной активности (АОА) тканей при свободнорадикальной патологии. Однако в организме существуют специфические механизмы ее регенерации. Так, восстановление аскорбиновой кислоты осуществляется за счет восстановленной формы глутатиона или НАДФН, НАДН или тиоредоксина.

Токоферол, или витамин Е, является единственным и самым мощным липидорастворимым антиоксидантом как в плазме, так и в любой клеточной мембране. АОА токоферолов связывают главным образом с взаимодействием с перекисными соединениями органической природы. Образующиеся фенольные радикалы токоферолов стабильны и не взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами, поэтому они не участвуют в продолжении цепных реакций. Общепринято, что действие токоферола сводится к защите от избыточного ПОЛ за счет очень высокой антирадикальной активности, стабилизации липидного состава и физического состояния бислоя (фактор структурной стабилизации мембран) и защите от деструкции, вызванной продуктами гидролиза фосфолипидов под действием фосфолипазы А₂.

Витамин С может взаимодействовать с радикалами токоферола, участвуя в его восстановлении, т. е. токоферол и аскорбиновая кислота могут выступать в этом процессе как синергисты. Установлено, что система тиоредоксина в эритроцитах в некоторых случаях может функционировать как восстановитель дегидроаскорбата и радикалов аскорбата. Учитывая тот факт, что аскорбиновая кислота участвует в рециклизации α-токоферола и тиоредоксинредуктаза млекопитающих восстанавливает дегидроаскорбат, тиоредоксинредуктаза может играть важную роль в общей антиоксидантной функции витамина Е.

Таким образом, АОЗ тканей включает различные по своему химическому строению соединения. Однако действие всех компонентов ферментативной и неферментативной АОЗ в нормально функционирующем организме четко сбалансировано между собой, что обеспечивает поддержание количества оксидантов тканей на физиологическом уровне.

Любая стрессорная реакция организма сопровождается кратковременным подъемом АФК и развитием окислительного стресса. Термин «окислительный стресс» не имеет четкого определения. В настоящее время он используется для обозначения широкой группы разнообразных взаимосвязанных явлений, включающих повышенную внутриклеточную генерацию АФК и окислительное повреждение молекулярных компонентов клетки. Триггерами окислительного стресса могут быть разнообразные факторы, от наследственных или приобретенных генетических дефектов (мутаций) или экологических факторов, до таких событий, как изменение метаболических потоков и степени восстановленности редокс-компонентов в клетках.

Состояние оксидативного стресса развивается при многих экстремальных состояниях, в т. ч. заболеваниях. К ним относятся атеросклероз и сопутствующие ему заболевания, воспалительные процессы любого генеза, радиационные поражения, онкозаболевания, бронхо-легочная патология и т. д. Процессы старения организма также развиваются на фоне оксидативного стресса.

Для оксидативного стресса в первую очередь характерно нарушение в соотношении анти- и прооксидантной систем в сторону повышения последней, отсутствие мобилизации активности АОЗ и нарушение сбалансированности самих компонентов этой системы. Начальные этапы запуска реакции генерации АФК при различных патологических состояниях могут отличаться, но уже на следующих этапах направленность и интенсивность свободнорадикальных процессов теряют свою специфичность и зависят от состояния и степени мобилизации АОЗ.

Так, при воспалительных процессах генерация АФК связана с состоянием «дыхательного взрыва». При контакте чужеродных агентов с фагоцитами наблюдается сборка мультиферментного мембранного комплекса НАДФН-оксидазы за счет взаимодействия мембранных и цитозольных ее компонентов. В результате НАДФН-оксидазной реакции происходит образование О₂. Параллельно включается в процесс фагоцитоза миелопероксидаза, что приводит к генерации НОСl, синглетного кислорода. Уровень Н₂О₂ повышается за счет аминоксидаз. Несмотря на то, что образование этих АФК при воспалительной реакции направлено на защиту от чужеродных частиц, патогенных микроорганизмов, сами активные радикалы могут вызвать повреждение ДНК, ферментов и других белков, а также прочих жизненно важных молекул клетки хозяина. Причем, некоторые короткоживущие кислородные радикалы, например гидроксильный, могут быть преобразованы в более стабильные липоперекисные радикалы, которые транспортируются на большие расстояния в организме и могут накапливаться в органах, богатых липидами.

Избыточная продукция радикалов фагоцитами характерна также для аутоиммунных заболеваний. Радикалы кислорода могут модифицировать антигены собственного организма таким образом, что они становятся чужеродными и к ним начинают вырабатываться антитела. В результате активации клетки в микроокружении фагоцита концентрируются протеолитические ферменты, миелопероксидазы, АФК и отмечается снижение рН до 6.0 и ниже. Это усиливает повреждение мембран клеток, коллагена, сухожилий и облегчает образование НО₂^•, более активного, чем О₂, вызывает выброс железа из трансферрина, что увеличивает образование НО^•.

Некоторые ткани (мозг, сетчатка глаза, легкие) обладают высокой чувствительностью к окислительному стрессу. В мозговой ткани это обусловлено ее биохимическими, физиологическими и анатомическими особенностями. Метаболические процессы в мозговой ткани отличаются высокой степенью зависимости от насыщения кислородом. Мозг использует для этих целей 1/5 часть поступающего в организм кислорода и обладает высокой скоростью процессов аэробного окисления. Мембраны нервных тканей головного мозга содержат высокие концентрации полиненасыщенных жирных кислот. Мозговая ткань богата ионами металлов переменной валентности, в частности железом. Для мозговой ткани характерна высокая скорость метаболизма биогенных аминов, что сопряжено с генерацией АФК. В частности, моноаминооксидазная реакция сопряжена с образованием Н₂О₂. Продукция АФК может быть связана с метаболизмом медиатора дофамина и его аутоокислением. В условиях окислительного стресса это может являться дополнительным источником генерации реакционно-способных радикальных продуктов, которые в присутствии металлов переменной валентности могут инициировать ПОЛ. В мозговой ткани микроглия функционирует подобно макрофагам, генерируя супероксидный анион-радикал, что имеет большое значение для центральной нервной системы, особенно в условиях инфекционного поражения. Для мозговой ткани характерна низкая активность отдельных компонентов ферментов АОЗ, в частности каталазы, которая локализована в микропероксисомах нейронов, и глутатионпероксидазы.

Т. к. нервная ткань является особенно чувствительной к АФК, что обусловлено высоким уровнем метаболизма, уникальным липидным составом и минимальным клеточным обновлением, окислительный стресс может способствовать инициации и прогрессированию ряда нейродегенеративных заболеваний. В настоящее время установлена роль окислительного стресса в развитии различных нейродегенеративных расстройств, таких, как амиотрофический латеральный склероз, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция и др.

Серьезные осложнения при трансплантации органов, инфаркте миокарда и инсульте связаны с ишемией и реперфузией, приводящим к повреждению тканей.

При ишемии основным источником АФК являются митохондрии. Нарушение системы дыхательных ферментов приводит к накоплению субстратов, коферментов, флавин- и гемсодержащих соединений в восстановленном состоянии, повышается восстановительный потенциал тканей. В этих условиях за счет избытка донаторов электронов и протонов может происходить утечка единичных электронов, сопряженная с одноэлектронным восстановлением О₂ и образованием О₂. При ишемии нарушается синтез АТФ, наблюдается частичная деполяризация мембран и перераспределение в тканях ионов Са²⁺, что приводит к повышению их уровня в цитозоле. Кальций активирует протеазы, которые превращают ксантиндегидрогеназу в ксантиноксидазу. В период ишемии усиленное потребление АТФ ведет к аккумуляции продуктов катаболизма пуринов гипоксантина и ксантина, которые в период реперфузии и притока кислорода метаболизируются ксантиноксидазой с образованием большого количества суперокисного аниона-радикала и перекиси водорода.

Немаловажным фактором усиления продукции АФК при гипоксии является увеличение содержания Fe²⁺ в цитоплазме. Освобождению ионов железа из белок-связанной формы может способствовать О₂, NO и ацидоз, возникающий при гипоксии. Кроме того, О₂ может восстанавливать Fe³⁺ до Fe²⁺ и, таким образом, способствовать накоплению Fe²⁺ в клетке. Fe²⁺ активирует ПОЛ путем разветвления цепей окисления в присутствии кислорода.

На более поздних стадиях ишемического поражения наблюдается приток в ткань нейтрофилов и других фагоцитирующих клеток, продуцирующих АФК, которые можно считать важными источниками образования активных метаболитов кислорода при гипоксии. Гипоксия непосредственно является одной из причин повышения адгезивных свойств гранулоцитов, а повреждение эндотелия сосудов вследствие активации фагоцитирующих клеток крови считают одним из основных факторов патогенеза реперфузионных или реоксигенационных нарушений.

Следует отметить, что на модели ишемии/реперфузии печени мышей установлена критическая роль в продукции АФК Rac1-регулируемой НАДФН-оксидазы, отличной от НАДФН-оксидазы фагоцитов.

Экспериментально вызванная ишемия и реперфузия сердца крыс приводит к активации редокс-чувствительных транскрипционных факторов NF-kB, AP-1, а также MAPкиназ JNK и p-38.

При патологических состояниях на фоне интенсивной генерации радикальных продуктов снижается АОЗ. Снижение активности ферментов-антиоксидантов может быть связано с мутацией и окислительной деструкцией соответствующих форм ДНК. В то же время сами АФК могут ингибировать активность ферментов-антиоксидантов. Так, Н₂О₂ тормозит активность СОД, а О₂– активность каталазы.

В условиях окислительного стресса наблюдается истощение компонентов неферментативной АОЗ, которые при нейтрализации радикальных продуктов переходят в неактивное состояние или образуют радикальные продукты разной степени токсичности. Процесс восстановления антирадикальной способности этих соединений в условиях оксидативного стресса снижен.

Следует отметить, что некоторые так называемые антиоксиданты в условиях оксидативного стресса, когда снижена ферментативная АОА, могут выступать в качестве прооксидантов. При состоянии оксидативного стресса возрастает восстановительный потенциал клеток за счет субстратов, коферментов, находящихся в восстановленном состоянии, что приводит к снижению рН в очагах ишемии до 5,0. Это создает условия для повышения пула «активных форм» металлов переменной валентности. В условиях повышенной генерации АФК они могут участвовать в образовании радикальных продуктов не только за счет ненасыщенных жирных кислот, но и при взаимодействии с некоторыми так называемыми антиоксидантами. Так, в присутствии Fe/Cu и О₂ тиолы (RSH) являются источниками радикала RS^•, О₂, Н₂О₂ и НО^•; НАДФН – радикала НАДФ^•, О₂; НО^•, аскорбиновая кислота – семидегидроаскорбат-радикала, НО^•, Н₂О₂.

Известно, что в сером и белом веществе мозга, в спинномозговой жидкости обнаружена высокая концентрация аскорбиновой кислоты, которая в отсутствие металлов переменной валентности играет роль антиоксиданта. Однако при поражении мозга, когда повышается уровень «активной формы» железа, аскорбиновая кислота начинает стимулировать генерацию НО^•.

Таким образом, при состоянии оксидативного стресса наблюдаются глубокие изменения в метаболизме белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов, водно-электролитном обмене, которые могут являться причиной тяжелых поражений тканей при ряде патологических состояний. Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов при состоянии оксидативного стресса, их роли в патогенезе ряда заболеваний может быть произведена только при комплексном анализе про- и антиоксидантных систем. Более того, в каждом конкретном случае выбор исследуемых звеньев свободнорадикального окисления и компонентов АОС должен быть целенаправленным, необходимым, достаточным и адекватным поставленным задачам. Это особенно важно в клинических и патофизиологических исследованиях.

Литература

1. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях // Биохимия. – 2005. – Т. 70, вып. 2. – С. 246–264.

2. Болдырев А.А. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона // Успехи физиол. наук. – 2003. – № 3. – С. 21–34.

3. Губский Ю.И., Беленичев И.Ф., Левицкий Е.Л., Горбачева С.В., Бухтиярова Н.В., Задорина О.В. Роль активных форм кислорода в функциональной активности МАРкиназного каскада, глобальных факторов транскрипции и развитии апоптоза (обзор литературы и собственных исследований) // Журн. АМН України. – 2008. – Т. 14, № 2. – С. 203–217.

4. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение. – СПб., 2006. – 400 с.

5. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. – М.: Наука / Интерпериодика, 2001. – 343 с.

6. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. – М.: Слово, 2006. – 556 с.

7. Муравлева Л.Е., Молотов-Лучанский В.Б., Клюев Д.А., Бакенова Р.А., Култанов Б.Ж., Танкибаева Н.А., Койков В.В., Омарова Г.А. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования // Фундаментальные исследования. – 2010. – № 1. – С. 74–78.

8. Рациональная нейропротекция / И.Ф. Беленичев, В.И. Черний, Ю.М. Колесник и др. – Донецк: Издатель Заславский А.Ю., 2009. – 262 с.

9. Сорокин А.Б., Ким Е.Р., Овчинников Л.П. Протеасомная система деградации и процессинга белков // Успехи биол. химии. – 2009. – Т. 49. – С. 3–76.

10. Турпаев К.Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. – 2002. – Т. 67, вып. 3. – С. 339–352.

11. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В. Свободнорадикальное окисление и старение. – СПб.: Наука, 2003. – 327 с.

12. Drőge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol. Rev. – 2002. – V. 82. – P. 47–95.

13. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. 3rd ed. – N. Y.: Oxford University Press, 1999. – 936 р.

14. Halliwell B. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? // J. Neurochem. – 2006. – V. 97. – P. 1634–1658.

15. Hawkins C.L., Davies M.J. Generation and propagation of radical reactions on proteins // Biochimica et Biophysica Acta. – 2001. – V. 1504. – P. 196–219.

16. Sayre L.M., Perry G., Smith M.A. Oxidative stress and neurotoxicity // Chem. Res. Toxicol. – 2008. – V. 21. – P. 172–188.