2.1. ЭЛЕКТРОННЫЕ УРОВНИ В БИОПОЛИМЕРАХ

Спектроскопические методы исследования в молекулярной биофизике играют центральную роль. Спектральные свойства молекул определяются набором энергетических уровней, характерным для данного соединения. Изменение конформации молекулы биополимера или взаимодействие её с другими молекулами (водой, гормонами, субстратами и т.д.) влияют на положение энергетических уровней, а, следовательно, и на спектральные характеристики макромолекулы.

Важную информацию о структуре молекул биополимеров получают исследуя их спектры.поглощения. Спектр поглощения есть график зависимости коэффициента поглощения от длины волны падающего света. Спектр поглощения в конденсированной фазе характеризуется набором полос поглощения, положение которых, ширина и высота определяются расстоянием между энергетическими уровнями и колебательной структурой этих уровней.

Макромолекулы содержат различные хромофорные группировки, ответственные за поглощение света в той или иной области спектра.

Состояние электрона в атоме описывается волновой функцией . Физический смысл волновой функции состоит в том, что квадрат волновой функции пропорционален вероятности () того, что электрон находится в объеме , то есть .

Различным состояниям электрона соответствуют разные волновые функции и, соответственно, разные распределения вероятности нахождения электрона в пространстве. Волновые функции электронов в атомах и молекулах называются орбиталями.

Сферически симметричные орбитали атомов (-орбитали) при образовании химических связей преобразуются в симметричные относительно вращения вокруг оси, проходящей через соединяемые атомы, -орбитали.

-орбитали атомов при образовании химической связи между ними преобразуются в - орбитали, обладающие симметрией относительно операции инверсии (отражение со смещением). -орбитали могут образовывать и -связи при соответствующей ориентации атомов друг относительно друга.

Электронная орбиталь может быть локализованной. Это значит, что плотность вероятности нахождения электрона вблизи определенного атома имеет максимум. Например, электроны атомов кислорода, не участвующие в образовании химических связей, локализованы вблизи этих атомов. Орбитали, заселяемые такими электронами, называются n-орбиталями.

П-электроны обычно делокализованы.Это значит, что орбиталь охватывает несколько атомов. Например, в молекуле хлорофилла электроны сопряженных двойных связей пиррольных радикалов делокализованы ("размазаны") по всему тетрапиррольному кольцу. Степень делокализации может быть различной. Все типы орбиталей имеют основное и возбужденное состояния, переходы между которыми могут быть индуцированы квантами света.

Спектральные свойства хромофоров зависят от того между какими орбиталями происходят переходы при поглощении или испускании света. Спектры поглощения белков имеют специфическую полосу поглощения с максимумом при 280 нм. Эта полоса обусловлена наличием в белках ароматических радикалов, принадлежащих остаткам тирозина, фенилаланина и триптофана.

Амидная группировка пептидной связи в белках ответственна за интенсивное поглощение при 190 нм. Эта полоса поглощения соответствует П П* переходам (электроны делокализованы по атомам азота, кислорода и углерода).

В области 210 - 220 нм имеется слабое поглощение, соответствующее n П* переходу (n-электрон локализован на атоме кислорода пептидной группы).

Электронные переходы при поглощении света характеризуются дипольными моментами перехода. При взаимодействии электромагнитной волны с молекулой происходит смещение элетронной плотности, в результате чего дипольный момент молекулы изменяется. Свойства молекул таковы, что электрическое поле световой волны должно действовать в определенном направлении, чтобы вызвать переход электрона с одной орбитали на другую. Используя поляризованный свет можно определить направление дипольного момента перехода в системе координат, связанной с молекулой. А это позволяет определять ориентацию поглощающих свет молекул (таких, например, как хлорофилл) в надмолекулярных структурах (например, в мембранах).

Спектры поглощения нуклеиновых кислот имеют максимум при 260 нм, обусловленный азотистыми основаниями нуклеотидов. Это поглощение связано с П П* переходами, происходящими в плоскости ароматических колец азотистых оснований. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера поглощение света описывается формулой:

(3)

где I₀ - интенсивность падающего света

I - интенсивность света, прошедшего через слой поглощающее го свет вещества

- коэффициент экстинкции

c - поглощающего вещества

- длина оптического пути (толщина поглощающего слоя)

Величина

(4)

называется оптической плотностью. Она пропорциональна концентрации поглощающего вещества и поэтому часто используется при определении концентрации. Измерение оптической плотности позволяет определить и толщину поглощающего слоя.

При переходе спираль клубок в ДНК интенсивность поглощения света при 260 нм увеличивается (до 30%). Это явление получило название гиперхромного эффекта. Уменьшение коэффициента поглощения называется гипохромным эффектом.

Физической причиной гиперхромного эффекта является изменение окружения хромофорной группировки. В двойной спирали азотистые основания расположены друг над другом стопкой (стэкинг) и взаимодействуют друг с другом. Это взаимодействие влияет на интенсивность поглощения света азотистыми основаниями (интенсивность поглощения уменьшается по сравнению с невзаимодействующими основаниями). В состоянии клубка стэкинг - взаимодействия нет, и азотистые основания поглощают свет уже независимо друг от друга.

Гиперхромный и гипохромный эффекты наблюдаются также в белках при конформационных переходах. Ароматические радикалы в состоянии глобулы взаимодействуют с другими радикалами в гидрофобном ядре молекулы. При переходе в состояние статистического клубка это взаимодействие нарушается и интенсивность поглощения света возрастает.

Таким образом, по интенсивности поглощения света на определенных длинах волн можно судить о конформации молекулы биополимера.

Весьма ценную информацию о внутримолекулярных процессах можно получить измеряя люминесценцию молекул. Люминесценция - это высвечивание молекулами квантов света при возвращении электрона с возбужденного энергетического уровня на основной.

Различные процессы преобразования энергии в молекулах могут быть представлены на схеме, которая содержит набор энергетических уровней и связей между ними.

Основные процессы могут быть отражены на схеме Яблонского (рис.1). Имеется три главных энергетических уровня – S₀, S₁, и Т. S₀ – это основное синглетное состояние молекулы. Суммарный спин молекулы в этом состоянии равен нулю. Поэтому Е магнитном поле молекула будет иметь один энергетический уровень (отсюда название "синглетный").

---------------- S₁

--------------- Т

---------------- S₀

Рис.1 Простейшая схема энергетических уровней в молекуле

S₁- это возбужденное синглетное состояние. Один из электронов, находящихся на уровне S₀ может поглотить квант энергии равный расстоянию между уровнями и S₀ и S₁, в результате чего он перейдет на уровень S₁.

Время жизни на уровне S₁ составляет 10^-12 –10^-8сек. Через указанный промежуток времени электрон вернётся на уровень S₀, а избыток энергии может быть либо высвечен в виде кванта света (этот процесс называется флуоресценцией), либо растрачен в тепло.

Возможен и другой процесс. Если за время жизни возбуждённого состояния в результате взаимодействия электрона с колебаниями решётки произойдёт переворот электронного спина, то суммарный спин молекулы станет равным единиц. При этом часть энергии диссипирует в тепло. Это означает, что электрон с синглетного уровня перешел на триплетный уровень Т. Молекула в триплетном состоянии, будучи помещена в магнитное поле, имеет три энергетических уровня, соответствующих трем ориентациям спина молекулы относительно направления внешнего магнитного поля - по полю, против поля и перпендикулярно полю.

Время жизни триплетного состояния значительно превышает времена жизни синглетных состояний. Оно лежит широком диапазоне от 10^-6 сек до минут.

Возбужденные состояния молекул обладают повышенной реакционной способностью. Поэтому многие реакции идут с ощутимой скоростью только, если хотя бы один из участников реакции находится в возбужденном состоянии.

Молекулы биополимеров содержат десятки хромофорных групп. Поглощение кванта света отдельной группировкой приводит к тому, что реакционная способность увеличивается локально, именно в том место, где локализована эта хромофорная группировка. Возможен, однако, и другой исход, когда поглощает свет одна группировка, но энергия переносится на другую и уже эта группировка вступает в химическую реакцию или высвечивает квант (сенсибилизированная люминесценция).