1.9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОПОЛИМЕРОВ

Самый мощный и информативный метод исследования биополимеров - это рентгеноструктурный анализ (РСА). Суть этого метода состоит в регистрации прошедших через кристалл исследуемого вещества рентгеновских лучей и анализе полученной картины отражений этих лучей от атомных плоскостей.

Длина волны рентгеновского излучения сравнима с размерами кристаллической ячейки, то есть с расстояниями между атомами в молекулах. По этому при прохождении рентгеновских лучей через кристалл они отражаются от кристаллических плоскостей и интерферируют. Интерференционная картина содержит информацию о расположении атомов в молекуле.

Используя метод РСА, Уотсон, Крик и Уилкинс расшифровали структуру ДНК, Перутц получил трехмерную структуру миоглобина. Эти работы были отмечены Нобелевской премией.

Для проведения РСА белок или нуклеиновую кислоту необходимо закристаллизовать. При этом структура полимера оказывается зафиксированной. Поэтому исследование динамических свойств структуры этим методом затруднительно. Для этого используются другие методы.

Среди них важнейшее значение имеют спектроскопические методы. Спектры поглощения и флуоресценции молекул в видимой и ультрафиолетовой областях зависят от межмолекулярных взаимодействий хромофорных группировок, входящих в состав молекулы. При изменении конформации молекулы взаимодействие хромофорных группировок с другими частями молекулы биополимера или молекулами растворителя (если хромофорная группировка находится на поверхности макромолекулы) изменяется. Это приводит к изменению спектральных характеристик хромофорных группировок - смещению максимума поглощения, изменению интенсивности поглощения или испускания света и т.д. Регистрируя изменения этих характеристик во времени, можно исследовать динамику конформационных переходов.

В последние годы разработаны новые спектроскопические методы исследования, которые позволяют выявлять в молекулах белков и нуклеиновых кислот спирализованные участки, участки. Например, метод дисперсии оптического вращения (ДОВ) позволяет исследовать образование и разрушение спиральных участков в белках. Физической основой метода является то, что при взаимодействии плоскополяризованного света с оптически анизотропной структурой (а к таким относятся и спирализованные участки) происходит вращение плоскости поляризации света. Это явление называется оптической активностью.

Поскольку разные хромофорные группировки дают вклад в ДОВ при различных длинах волн, измеряя ДОВ для соответсвующих оптических переходов, можно определить конформацию отдельных участков макромолекулы. Например, поглощение света белками в области 190 - 230 нм обусловлено пептидной связью. Спектры ДОВ в этой области для спирали, структуры и неупорядоченного участка различны, что и позволяет по изменению спектра ДОВ следить за изменением конформации полипептидного остова белковой молекулы.

Различные типы вторичной структуры могут быть выявлены и с помощью спектроскопии в инфракрасной области спектра (ИК - спектроскопии). Поглощение электромагнитных волн в этой области спектра (длина волны от нескольких микрон до миллиметров) обусловлено колебаниями атомов в молекуле. Частота этих колебаний зависит от химических связей и межмолекулярных взаимодействий, в которых участвуют атомы. например, наличие водородной связи –С=О…Н-N- в белках влияет на частоту валентных колебаний –С=О и деформационных колебаний -N-H групп. Поэтому по спектрам в инфракрасной области можно отличить и структуры от статистического клубка (в котором водородные связи не образуются).

В последние годы для исследования третичной структуры белков и нуклеиновых кислот используются радиоспектроскопические методы: метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Физической основой этих методов является эффект расщепления энергетических уровней электрона или ядра, имеющего ненулевой спин, в магнитном поле (эффект Зеемана).

Неспаренный электрон в магнитном поле может находиться на одном из двух энергетических уровней, соответствующих двум возможным ориентациям электронного спина - по полю и против поля. Расстояние между этими энергетическими уровнями определяется формулой:

где расстояние между энергетическими уровнями

фактор спектроскопического расщепления

напряженность магнитного поля

Электромагнитные волны с частотой, определяемой соотношением:

где постоянная Планка

частота электромагнитных волн

вызывают переходы между этими двумя уровнями. Если переход происходит с нижнего уровня на верхний, то энергия кванта поглощается.

Спектр ЭПР есть зависимость интенсивности поглощения электромагнитной энергии образцом, помещенным в магнитное поле, от напряженности этого поля.

По спектру ЭПР можно определить природу, концентрацию свободных радикалов, характер их движения.

На основе метода ЭПР разработан новый метод исследования молекул биополимеров, биомембран и других клеточных структур, называемый методом спиновых меток. Суть этого метода состоит в следующем: к молекуле биополимера прикрепляется ковалентной связью молекулярный фрагмент, содержащий неспаренный электрон - метку - по спектру ЭПР которого можно судить о микровязкости среды, в которой этот парамагнитный фрагмент совершает броуновское вращение вокруг химической связи, которой он прикреплен к молекуле биополимера.

Если спиновая метка находится на поверхности белковой глобулы, то микровязкость её окружения невелика, и она может совершать быстрые вращения (что отражается на спектре ЭПР). Если же спиновая метка находится в толще третичной структуры молекулы белка, то микровязкость окружения велика и вращение заторможено.

При изменении конформации белковой молекулы микровязкость окружения метки может измениться, что и отразится на спектре ЭПР.

Спектры ЯМР молекул чувствительны к влиянию различных атомных группировок на ядра, поглощающие электромагнитную энергию. Поскольку при изменении конформации молекулы расстояния между атомными группировками изменяются, влияния их друг на друга тоже изменяется. Поэтому спектры ЯМР зависят от конформации молекулы биополимера. Изменение подвижности атомных группировок также сказывается на спектрах ЯМР. Поэтому ЯМР используют для исследования не только статической структуры, но и динамических характеристик молекул биополимеров.

Поскольку ЯМР - спектроскопия позволяет исследовать молекулы в растворе, появляется возможность изучать взаимодействие биополимеров с различными физиологически активными соединениями и тем самым выяснять механизмы их действия.

Одним, из последних достижений в исследовании структуры биополимеров стало применение туннельной микроскопии. Этот новый метод позволяет исследовать структуру молекул биополимеров с атомным разрешением. Вероятно, в ближайшее время с помощью туннельного микроскопа станет возможным "читать" первичные структуры нуклеиновых кислот и белков.

Упомянутые в этом параграфе физические методы исследования далеко не исчерпывают всего многообразия используемых в экспериментальной практике приёмов. Детально ознакомиться с тем или иным методом можно по соответствующим руководствам.