РАЗДЕЛ 1. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, ДИНАМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОПОЛИМЕРОВ
1.1.
БИОПОЛИМЕРЫ КАК СТРУКТУРНАЯ
ОСНОВА ЖИЗНИ
Жизнь возникла на молекулярном
уровне. Согласно современным представлениям органический мир эволюционировал от
простейших форм жизни ко все более сложным. В "первичном бульоне"
сначала шла химическая эволюция: из простых соединений образовывались более
сложные.
В соответствии с
законами физики и химии на определенном этапе химической эволюции возникли
полипептиды и полинуклеотиды.
Физико-химические свойства этих двух типов макромолекул
существенно отличаются.
Полинуклеотиды, в силу своего
химического строения, способны к комплиментарному взаимодействию на уровне
первичной структуры. Это линейные полимеры с мономерными звеньями, имеющими
боковые радикалы (азотистые основания), способные образовывать водородные связи
с комплементарными свободными нуклеотидами. В результате комплементарных
взаимодействий образуются стабильные комплексы, в которых возможны дальнейшие
химические процессы, важнейшим из которых является соединение свободных нуклеотидов
в полинуклеотидную цепь.
В силу комплементарности
взаимодействий последовательность мономерных звеньев в новой полинуклеотидной
цепи оказывается "слепком" последовательности исходной (родительской)
полинуклеотидной цепи.
Таким образом, химическое
строение полинуклеотидов таково, что они могут играть роль матриц при
полимеризации свободных полинуклеогидов. Матричный синтез полинуклеотидов - это
и есть простейший (но и важнейший) жизненный акт, простейшее проявление жизни.
Химическое строение полипептидов
таково, что они оказываются способными образовывать сложные третичные структуры
и поэтому к комплементарному взаимодействию на уровне первичной структуры не
способны. А это значит, что считывание информации с первичной структуры белков
невозможно.
Таким образом, свойства белков являются
физической основой центральной догмы
биологии.
Разнообразие третичных структур
белков ведет к многообразию функций белковых молекул. Практически все
"исполнительные" функции в живом осуществляются белками. В то время
как нуклеиновые кислоты осуществляют "законодательную власть".
На каком-то этапе химической эволюции белки и нуклеиновые
кислоты объединились в самовоспроизводящиеся системы гиперциклы. Для этого потребовалось,
чтобы возник механизм кодирования: последовательность мономерных звеньев
нуклеиновой кислоты должна была каким – то образом определять последовательность мономерных звеньев в
белке.
Механизм возникновения кода –
одна из до сих пор решённых проблем.
Как только возник код, ситуация
изменилась качественно. Теперь уже белок и нуклеиновая кислота могли
"сотрудничать" в матричном синтезе. При конкуренции различных матриц
за ограниченное количество субстрата (свободные нуклеотиды) в термодинамически
неравновесных условиях (нелинейная область) начался естественный отбор матриц.
"Выживали" матрицы, которые копировались точнее и быстрее. Точность и
быстрота обеспечивались белком, а его свойства, в свою очередь, определялись
первичной структурой полинуклеотидной матрицы. Так белок и нуклеиновая кислота
образовали функциональное целое.
На этой стадии развития
органического мира эволюция макромолекул находилась под сильным влиянием
физико-химических факторов среды. Позднее, когда возникли более высокоорганизованные
формы жизни, эволюция макромолекул определялась уже не только
физико-химическими факторами, но и более сложными процессами, протекающими на
вышележащих иерархических уровнях.
На первых этапах эволюции отбор
действовал непосредственно на сами матрицы. На более поздних этапах отбору
подвергаются организмы (фенотипы). Таким образом, отбор матриц теперь опосредован
надмолекулярными структурами. Действие
отбора привело к тому, что мы называем соответствием между структурой и
функцией на молекулярном уровне.
Молекулярная биофизика изучает
структуру и функции биологических систем на уровне молекул. Хотя современные
живые организмы - это макроскопические системы, жизнь, по существу, остается
явлением молекулярного уровня. Только молекулы могут быть идентичны друг другу
в силу квантовых свойств микромира. Поэтому истинное воспроизведение себе
подобного возможно лишь на молекулярном уровне. Вероятность образования двух
идентичных макроскопических систем практически равна нулю. Все иные известные
формы жизни основаны на макромолекулярных структурах.
Генетическая информация записана
на молекулярном носителе. Существуют ли другие (не молекулярные) Формы записи информации
в биологических системах? Нам не известны иные хранилища информации кроме
молекулярных. Как записывается информация в мозге высокоорганизованных
животных, пока не известно.
Ясно, что выполнимая инструкция (информация)
может быть записана только в дискретной форме. Поэтому запись информации в
молекулярной форме в биологических системах практически неизбежна. Так как,
молекула биополимера представляет собой естественный текст, алфавитом которого
являются различные типы мономеров.
Таким образом, два важнейших атрибута
жизни - хранение информации и воспроизведение - имеют молекулярную природу. Из
вышесказанного следует, что молекулярная природа жизни предопределена физическими
свойствами материального миря.
1.2. УРОВНИ
ОПИСАНИЯ СТРУКТУРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ
В настоящее время используется
четыре уровня описания структуры биополимеров. Важно понять, что структура
молекулы одна и та же, но уровни описания ее могут быть разными.
Первичная структура - описание
последовательности мономерных звеньев в полимерной цепи. Первичная структура
белков есть описание последовательности аминокислотных остатков в полипептидной
цепи. Первичная структура нуклеиновых кислот есть описание последовательности
нуклеотидов в полинуклеотидной цепи.
В обоих типах биополимеров
первичная структура имеет направленность. В белках аминокислотные остатки
соединены "голова" к "хвосту" так, что на одном конце цепи
имеется свободная аминогруппа, а на другом - свободная карбоксильная группа. Синтез
белка идет в направлении от NH - конца к СООН - концу. У нуклеиновых кислот на одном конце
имеется свободная 
– ОН - группа, а на противоположном - 
- ОН - группа. Синтез ДНК идет в направлении 
.
Первичная структура молекулы биополимера
во многом определяет более высокие уровни ее организации. Поэтому определение
первичной структуры молекул биополимеров является важнейшей задачей молекулярной
биологии.
Вторичная структура - описание
взаимного расположения ближайших соседей в полимерной цепи.
В белках и нуклеиновых кислотах
различные части молекулы обычно имеют разную вторичную структуру. В белках
спирализованные участки чередуются с участками, не имеющими регулярного
расположения аминокислотных остатков (это, однако, не означает, что
расположение мономеров в этих участках произвольно и может меняться от молекулы
к молекуле).
Третичная структура - описание
взаимного расположения удаленных в первичной последовательности мономеров.
Третичная структура описывает пространственную организацию молекулы биополимера
как целого. Например, молекула белка может иметь форму глобулы или вытянутой
нити. Соответствующие белки называются глобулярными и фибриллярными. При
описании третичной структуры могут быть указаны и более мелкие подробности, например,
наличие на поверхности глобулы щели, углубления, кармана и т.д.
При изменении физико-химических
условий (температура, рН, ионная сила и пр.) третичная структура может
изменяться, что играет важную роль в регуляции функций молекул биополимеров.
Четвертичная структура - описание
субъединичного строения функционально активной молекулы биополимера. Часто
молекула биополимера, выполняющая сложную функцию, состоит из нескольких субъединиц, образующих комплекс,
стабилизированный нековалентными взаимодействиями.
Количественный и качественный состав
субъединиц и их взаимное расположение в комплексе обычно стабильны. Поэтому говорят
об определенной четвертичной структуре, указывая количество субъединиц каждого
типа. Например, гемоглобин имеет четвертичную структуру 
.
Это означает, что в состав молекулы гемоглобина входит две 
-
субъединицы и две 
-субъединицы.
У некоторых белков четвертичная структура не фиксирована, и число субъединиц
может варьировать.
При описании структуры молекул
используются еще два термина - конфигурация и конформация. Под конфигурацией
понимают описание расположения атомов в мономерных звеньях бионолимеров. Под
конформацией понимают описание более или менее устойчивых расположений атомов,
если речь идет о конформации мономерных звеньев, или о расположении самих
мономерных звеньев, если речь идет о конформации молекулы биополимера в целом.
Конформация макромолекулы изменяется в
результате вращения атомных группировок вокруг химических связей. Эти вращения
могут быть вызваны тепловыми столкновениями или межмолекулярными
взаимодействиями. Например, мономерные звенья могут поворачиваться относительно
связей, соединяющих их друг с другом. Вращения вокруг связей играют важную роль
в формировании третичной структуры биополимеров.
1.3. СИЛЫ, СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ СТРУКТУРНЫЕ УРОВНИ МОЛЕКУЛ
БИОПОЛИМЕРОВ
Первичная структура фиксирована
прочными ковалентными связями между мономерными звеньями. В белках это
пептидные связи, в нуклеиновых кислотах - фосфодиэфирные связи. Прочность этих
связей такова, что тепловые колебания, имеющие среднюю энергию примерно 0.6
ккал/моль, не могут разорвать эти связи. Поэтому первичная структура молекулы
биополимера остается неизменной на протяжении всего времени жизни данной
молекулы. Если по какой-либо причине первичная структура будет нарушена, то
соответствующая молекула, обычно, подвергается деградации на мономеры.
Некоторые теории старения
организмов основаны на предположении о том, что определенная доля “испорченных”
молекул белков не деградирует, и поэтому с течением жизни в клетке накапливаются
аберрантные белки, что в конечном итоге приводит к снижению функций.
Поддержание неизменной первичной
структуры нуклеиновых кислот на протяжении онтогенеза является необходимым
условием нормального функционирования организма. Поэтому существуют специальные
ферментные системы, которые проверяют нативность структуры ДНК и репарируют
поврежденные участки. В последнее
время появились работы, в которых сообщается о существовании ферментов, репарирующих
некоторые нарушения первичной структуры белков.
Известно, что функционирование
молекулярных устройств сопряжено с движением различных частей макромолекулы
друг относительно друга (как и в макроскопических машинах). Поэтому вторичная и
третичная структуры биополимеров должны быть подвижными.
Вторичная, третичная и
четвертичная структуры макромолекул стабилизированы слабыми силами. Сюда
относятся нехимические межмолекулярные взаимодействия различного вида: электростатические
взаимодействия, дисперсионные силы, водородная связь. Энергия этих
взаимодействий лишь в несколько раз превосходит среднюю кинетическую энергию
тепловых колебаний. Это значит, что тепловое движение молекул может разрывать
слабые связи. Поэтому структуры, стабилизированные слабыми связями, сохраняют
определенную подвижность. Именно в этом и состоит смысл выбора, осуществленного
Природой при формировании высших уровней организации молекул биополимеров:
множеством слабых взаимодействий с одной стороны, сделать структуру достаточно
стабильной, и в то же время сохранить определенную подвижность, необходимую для
функционирования.
Хотя энергия слабых различных связей
примерно одинакова, физические механизмы взаимодействий, лежащих в основе этих
связей, отличны. Поэтому изменения различных физико-химических факторов
(температуры, рН, ионной силы, диэлектрической проницаемости и т.д.) по-разному
влияют на энергию этих взаимодействий. Отсюда следует, что анализ механизмов
функционирования молекулярных устройств невозможен без изучения баланса слабых
различных сил, определяющих стабильность структуры биополимера.
Изменение физико-химических условий
влияет на баланс этих сил, а это уже вызывает перемещение частей молекулы друг
относительно друга к новому соотношению сил.
Макромолекулы имеют сотни различных атомных
группировок, свойства которых различны. Сложная мозаика слабых сил, действующих
в молекуле биополимера (и между молекулами) обусловлена этим разнообразием
атомных группировок.
Рассмотрим основные типы слабых
межмолекулярных взаимодействий.
Электростатические взаимодействия.
В состав молекул биополимеров входят различные ионогенные группировки:
аминогруппы, карбоксильные, фосфатные, гуанидиниевые, имидазольные, спиртовые,
амидные. При рН близких к нейтральному многие из них ионизуются, и поэтому в
месте локализации этих группировок молекула биополимера несёт соответствующий
электрический заряд. Эти фиксированные на молекуле заряды взаимодействуют друг с другом по законам электростатики:
одноименные заряды отталкиваются, разноименные - притягиваются. Например, в
двойной спирали ДНК сахаро - фосфатный остов полинуклеотидных цепей содержит
остатки фосфорной кислоты, которые при диссоциации приобретают отрицательный
заряд. Это ведет к отталкиванию двух полинуклеотидных цепей друг от друга, что
дестабилизирует структуру двойной спирали.
Электростатические взаимодействия
ослабляются в среде с большой диэлектрической проницаемостью или при высокой ионной
силе. Поэтому электростатические взаимодействия усиливаются при переходе из
водной среды в липидную фазу мембран.
Локальное
уменьшение диэлектрической проницаемости может значительно увеличить
электростатическое взаимодействие. И это может быть использовано в механизмах
функционирования молекул биополимеров. Взаимодействие молекулы биополимера с каким-либо
лигандом, то есть, с низкомолекулярным соединением, может вызвать локальное
изменение диэлектрической проницаемости в области расположения
взаимодействующих зарядов, а это приведет к изменению соотношения действующих в
этом участке сил, и структура молекулы может локально измениться.
Энергия электростатических
взаимодействий обратнопропорциональна расстоянию между взаимодействующими
зарядами.
Электростатические взаимодействия относительно дальнодействующие.
Например, два электрона взаимодействуют на расстоянии 20А° в среде с относительной
диэлектрической проницаемостью 80 с энергией 1.73 кдж/моль (для сравнения,
средняя энергия тепловых колебаний составляет при комнатной температуре
примерно 2.5 кдж/моль). На таком расстоянии дисперсионные силы между двумя
атомами водорода практически равны нулю.
Энергия взаимодействия статических
диполей на малых расстояниях может быть вычислена как сумма энергий
взаимодействия зарядов, образующих диполи. На расстояниях значительно превышающих
размерам самих диполей, энергия диполь-дипольных взаимодействий
обратнопропорциональна квадрату расстояния между диполями.
Дисперсионные взаимодействия. Эти взаимодействия возникают
между атомами вследствие флуктуации электронной плотности вокруг ядра, что
приводит к появлению мгновенного дипольного момента у атомов и взаимодействию
соответствующих диполей. Дисперсионное взаимодействие имеет место между любыми
атомными группировками, но оно больше в тех случаях, когда поляризуемость атомов
выше.
При повышении температуры
флуктуации электронной плотности возрастают, поэтому и дисперсионные
взаимодействия усиливаются. При низких температурах эти взаимодействия ослабевают.
Гидрофобные участки макромолекул
притягиваются друг к другу, главным образом, за счет дисперсионных сил. Эти
силы слабо зависят от рН, ионной силы. Поэтому изменение этих параметров сильнее
будет влиять на электростатические взаимодействия и в меньшей степени изменять
дисперсионные силы.
В белках дисперсионные силы играют важную роль
во взаимодействии аминокислотных остатков, имеющих гидрофобные (неполярные)
боковые радикалы, таких как, например, валин, лейцин, триптофан, фенилаланин,
тирозин. В нуклеиновых кислотах дисперсионные взаимодействия возникают между
азотистыми основаниями нуклеотидов, расположенных друг над другом в полинуклеотидной
цепи (стэкинг - взаимодействие).
Энергия дисперсионных
взаимодействий обратнопропорциональна шестой степени расстояния между
взаимодействующими атомами. Это значит, что дисперсионные силы играют существенную
роль лишь на очень коротких расстояниях.
Водородная связь. Водородная связь возникает
между двумя электроотрицательными атомами, притягивающими к себе атом водорода,
находящийся между ними.
В белках и нуклеиновых кислотах
водородные связи устанавливаются чаще всего между атомами кислорода и азота.
Спиральные участки вторичной структуры белков, как известно, стабилизированы
водородными связями между атомами азота и кислорода амидных группировок
полипептидного остова. Комплиментарные взаимодействия нуклеотидов в нуклеиновых
кислотах обусловлены спариванием азотистых оснований посредством водородных
связей.
Энергия,
необходимая для разрыва водородной связи, невелика (5 - 10 ккал/моль), поэтому
тепловое движение легко разрывает одиночные водородные связи.
Важное значение имеет тот факт, что
молекулы воды тоже способны образовывать водородные связи. Поскольку многие
белки находятся в водной фазе, их атомные группировки могут образовывать
водородные связи с молекулами воды. Если амидные группировки пептидных связей
будут образовывать водородные связи с водой а не друг с другом, то спиральная
конформация полипептидного остова дестабилизируется и разрушится. Ясно, что
вещества, способные конкурировать за образование водородных связей с гетероатомами
молекул биополимеров, будут дестабилизировать структуры, скрепленные
водородными связями.
Длина водородной связи составляет
приблизительно 2.5 А0. Следовательно, водородные связи действуют на
очень коротких расстояниях между атомными группировками.
Следует отметить, что все слабые
одиночные связи не могут противостоять тепловым столкновениям. Поэтому для
стабилизации вторичной, третичной и четвертичной структуры необходимо много
слабых связей. Именно это и имеет место в действительности.
В процессе адаптации к различным условиям
внешней среды в клетке могут использоваться различные виды межмолекулярных
взаимодействий. Например, связывание субстрата в активном центре фермента может
осуществляться за счет различных сил. При низких температурах дисперсионные
силы становятся не эффективными, и им на смену могут придти электростатические
взаимодействия. Механизм адаптации в этом случае состоит в замене гидрофобных
аминокислотных остатков, формирующих якорный участок активного центра фермента,
на ионогенные.
1.4. ГИДРОФОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Вода является матрицей жизни.
Большинство биологических структур формируется в водном окружении, и это
создает определенный термодинамический фон для этих процессов. Правило: подобное
растворимо в подобном справедливо и при формировании структур белков,
нуклеиновых кислот, биомембран.
Белки состоят из аминокислотных остатков,
несущих гидрофобные и гидрофильные боковые радикалы. При укладке полипептидной
цепи в глобулярную третичную структуру важную роль играют взаимодействия
боковых радикалов с водой. Гидрофильные остатки гидратируются и имеют тенденцию
остаться на поверхности глобулы, а гидрофобные не связывают молекулы воды, и поэтому
образуют внутреннее ядро глобулы. Таким образом, в общих чертах структура
глобулы может быть охарактеризована так: гидрофобное ядро и гидрофильная
оболочка.
Это, конечно, не значит, что на
поверхности белковой глобулы вообще нет ни одного гидрофобного аминокислотного
остатка. Закономерность состоит в том, что число таких остатков на поверхности
минимально. Если на поверхности белковой глобулы слишком много гидрофобных
остатков (более 30%), то появляется тенденция к агрегации белковых молекул в
комплексы. Они как бы слипаются гидрофобными областями, в результате чего
площадь поверхности соприкосновения гидрофобных радикалов с водой уменьшается.
Этот физический принцип лежит в основе образования четвертичной структуры
многих белков.
Формирование структуры двойной
спирали ДНК также происходит под влиянием гидрофобных взаимодействий. Спираль
закручена таким образом, что гидрофобные остатки азотистых оснований оказываются
внутри спирали, где их контакт с водой ограничен, а гидрофильный сахаро –
фосфатный остов оказывается на поверхности.
Наконец, структура биомембран такова,
что гидрофильные части липидных 
молекул
находятся на поверхности мембраны, а их гидрофобные "хвосты" образуют
внутреннюю область. Взаимодействие белков с мембранами определяется
соотношением в них гидрофобных и гидрофильных остатков и их расположением на поверхности
белковой молекулы. Чем больше в белке гидрофобных аминокислотных остатков, тем
глубже он погружается в мембрану.
Интегральные белки
мембран обладают большей гидрофобностью, чем поверхностные. Для предсказания поведения мембранных
белков была сконструирована специальная функция:
где 
- изменение свободной энергии при переносе
аминокислотного остатка из водной среды в липидную
- число полярных аминокислотных остатков 
-
того сорта в данном белке
-
число неполярных аминокислотных остатков 
-
того сорта в данном белке
Чем больше значение 
,
тем лучше белок встраивается в липидную матрицу мембраны. Процессы, ведущие к
ограничению площади контакта гидрофобных радикалов с водой, получили название
гидрофобных взаимодействий.
1.5. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ПРИРОДА КОНФОРМАЦИИ
БИОПОЛИМЕРОВ
Для понимания процесса
формирования третичной структуры белков рассмотрим простейшую модель полимерной
цепи. Эта модель называется свободно-сочлененной цепью.
Предполагается, что имеется полимерная цепь
из 
мономерных звеньев, каждое длиной 1. Таким
образом, в полностью вытянутом состоянии (конформации) такая цепь имеет длину
1
. Далее в модели предполагается, что
допустимы вращения вокруг связей, соединяющих звенья, на любые углы, и при этом
не приходится преодолевать значительных энергетических барьеров. Вандерваальсовыми
взаимодействиями между мономерными звеньями пренебрегают.
В такой полимерной цепи, находящейся в
окружении молекул растворителя, будет происходить броуновское вращение вокруг
всех связей. В результате чего пространственное расположение различных частей
молекулы друг относительно друга будет постоянно изменяться.
Если характеризовать конформацию
полимерной цепи такой, например, величиной, как расстояние между ее началом и концом,
то эта величина будет случайным образом изменяться во времени в соответствии с
тем, как цепь будет скручиваться или выпрямляться под влиянием броуновской
бомбардировки молекулами растворителя.
Теория вероятности позволяет
вычислить среднее расстояние между концами свободно-сочлененной цепи. Оно
оказывается равным 1
.Это
значит, что в среднем свободно-сочлененная цепь имеет скрученную конформацию.
Эта конформация была названа клубком.
Реальные молекулы, конечно, во многом
отличаются от этой модели. Не любые вращения допустимы, так как мономерные звенья
имеют определенный объем и два звена не могут одновременно находиться в одной и
той же части пространства. Кроме того, вращения вокруг химических связей
сопряжены с преодолением энергетических барьеров, высота которых зачастую
превосходит среднюю энергию тепловых столкновений. И, наконец, между атомными
группировками мономерных звеньев при их сближения возникают вандерваальсовы
взаимодействия, что также влияет на динамику вращения вокруг связей.
Однако при достаточно высокой
температуре и большом числе мономерных звеньев полимерная цепь ведет себя
подобно свободно-сочлененной, то есть находится в конформации клубка. При низкой
температуре тепловые столкновения уже не могут разорвать вандерваальсовых
контактов, клубок уплотняется, и в конечном итоге молекула приобретает
конформацию плотной глобулы.
В глобуле подвижность мономерных звеньев
значительно ограничена. За счет различных вандерваальсовых взаимодействий
внутренняя часть глобулы приобретает свойства твердого тела. Исследование
сжимаемости белков в растворе показало, что коэффициент сжимаемости для белка
составляет величину порядка 
.
Это значение меньше, чем значения для жидкостей 
,
но больше, чем для металлов 
.
Мы видим, что изменения температуры могут вызывать
переходы клубок 
глобула.
Исследования таких переходов в белках показало, что они похожи на фазовые
переходы.
Рассмотрим фазовые
переходы в биополимерах.
1.6. ФАЗОВЫЕ ПЕРЕХОДЫ В БЕЛКАХ И
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТАХ
Фазовые переходы - это резкое
изменение структуры вещества при плавном изменении какого-либо параметра
(температуры, давления, концентрации и т.д.) системы. Резкое изменение
структуры происходит тогда, когда эта структура стабилизирована множеством
слабых взаимодействий.
Мы уже видели, что вторичная и третичная
структуры стабилизированы множеством слабых вандерваальсовых взаимодействий.
Это создает предпосылки для кооперативного поведения высших структур.
Исследование зависимости структуры
молекулы ДНК в водном растворе от температуры показало, что при низких температурах
она имеет форму двойной спирали - две полинуклеотидные нити закручены друг
относительно друга в спираль, шаг которой состоит из десяти пар азотистых
оснований, спаренных друг с другом водородными связями. Пары 
скреплены двумя водородными связями, а 
-
тремя. В среднем на каждую пару приходится 2.5 водородные связи.
Ясно, что более или менее протяжённый
участок двойной спирали стабилизирован десятками и сотнями водородных связей.
Разрыв каждой из них в отдельности требует немного энергии и поэтому имеет
большую вероятность. Однако для разделения двойной спирали на две нити нужно
разорвать одновременно много водородных связей. Вероятность этого события при
низких температурах невелика.
Если в качестве грубого приближения
предположить независимость прочности
водородных связей друг от друга, то вероятность разрыва 100 водородных связей
(соответствует 4-м шагам спирали) будет равна
,
где 
-
вероятность разрыва одиночной связи. Вычислим при 
и 
.Получим
соответственно 6
и
. Величина
увеличилась лишь на 3% , а увеличилось в 22 раза. Отсюда ясно, что малые
изменения вероятности разрыва одиночной водородной связи могут привести к
резкому увеличению вероятности разрыва множества таких связей, а это означает
резкое ослабление структуры двойной спирали.
При повышении температуры вероятность разрыва отдельной
водородной связи увеличивается, так как средняя энергия тепловых столкновений
при, повышении температуры увеличивается. Когда эта вероятность приблизится к
единице, произойдет резкое увеличение вероятности одновременного разрыва
большого количества водородных связей, скрепляющих двойную спираль. Это
приведет к переходу конформации молекулы от спирали к клубку. Переход этот
произойдет в относительно узком температурном интервале, так как вблизи
значений 
изменение лишь на несколько процентов приводит к практически
скачкообразному изменению стабильности структуры двойной спирали.
Эти расчеты позволяют понять на
качественном уровне причины фазовых переходов в биополимерах. Более
реалистические модели учитывают многие другие особенности внутримолекулярных
взаимодействий в биополимерах.
Переходы глобуса клубок в белках тоже напоминают фазовые. В
зависимости от природы сил, стабилизирующих глобулу, наблюдаются резкие
изменения структуры белковой молекулы при плавном изменении температуры, ионной
силы или
.Физическая
природа кооперативности и в этих случаях такая же как и в нуклеиновых кислотах
- множественность слабых взаимодействий, скрепляющих третичную структуру.
Количественное описание фазовых переходов в биополимерах можно осуществить с
помощью простых моделей. Предположим, что полимерная цепь может находиться либо
в спиральном состоянии, либо в клубковом. Это значит, что все мономерные звенья
цепи могут одновременно находиться либо
в одном, либо в другом состоянии. Обычно в спиральном состоянии потенциальная
энергия мономерного звена меньше, чем в клубковом. Изменение свободной энергии
при переходе из спирального состояния в клубковое обозначим:
(2)
где 
- изменение
свободной энергии мономерного звена при
переходе из спирали в клубок
- изменение
энтальпии
- изменение энтропии
Константа равновесия
конформационного перехода спираль клубок в соответствии с законом действующих
масс равна:
где 
- константа
равновесия перехода спираль клубок для молекулы полимера
-
константа равновесия перехода спираль клубок для мономерного звена
n - число мономерных звеньев в молекуле полимера
Поскольку
стандартное изменение свободной энергии определяется формулой:
для перехода
спираль клубок получим
(1)
При увеличении температуры
константа равновесия перехода также увеличивается, так как стабильность
спиральной конформации уменьшается. При некоторой температуре 
константа равновесия будет равна единице, 
.
Это значит, что при 
половина молекул полимера находится в
спиральном состоянии, а другая половина - в клубковом, то есть соответствует
середине фазового перехода. Из (1) получим:
Отсюда видно, что температура
фазового перехода спираль клубок
зависит от отношения энтальпии перехода
к энтропии перехода для мономерных звеньев. Величина 
тем больше, чем прочнее связи, стабилизирующие
спиральную структуру. Изменение энтропии зависит от того, насколько ограничено
было движение мономерного звена в спирализованном состоянии и насколько оно
стало свободным в клубковом состоянии.
Температура плавления двойной
спирали ДНК зависит от нуклеотидного состава: чем больше доля 
пар в первичной структуре, тем выше температура
плавления спирали. Это объясняется тем, что пары образованы тремя водородными связями, а 
пары - двумя. Значит для пар больше, чем для пар, следовательно, и будет больше.
Прочность спиральных структур в белках и
нуклеиновых кислотах зависит не только от числа водородных связей, приходящихся
на шаг спирали. Важное значение могут иметь электростатические взаимодействия,
дисперсионные силы.
Например, сахаро - фосфатные
остовы полинуклеотидных цепей отталкиваются друг от друга, поскольку несут
отрицательные заряды остатков фосфорной кислоты. Это приводит к дестабилизации
двойной спирали. Уменьшение ионной силы раствора ДНК приводит к понижению
температуры плавления двойной спирали. Почему? Чем меньше ионная сила раствора,
тем меньше экранируются электрические заряды друг от друга. Поэтому их
взаимодействие усиливается при низких значениях ионной силы. Одноимённые заряды
отталкиваются друг от друга. Следовательно, отталкивание нитей двойной спирали
будет увеличиваться при уменьшении ионной силы.
Важной характеристикой фазового
перехода является его ширина. Если переход из одного состояния в другое связан
с одновременным изменением состояния большого числа частиц, то переход будет
резким. Если затрагивается небольшое число частиц - широким. Анализ показывает,
что в выше рассмотренном случае резкость фазового перехода пропорциональна
величине:
Это значит, что протяженные
участки спирали плавятся в более узком температурном интервале, а короткие
участки - в широком. Ширина фазового перехода имеет очень большое значение в
биологических системах. Например, рецепторная система гремучей змеи
регистрирует разницу температур в
Ясно, что чем резче фазовый переход, тем
более чувствительная система регистрации на нем может быть создана.
1.7. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДСКАЗАНИЯ
ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ ПО ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЕ
Первичная структура биополимеров
определяет вторичную, третичную и четвертичную " структуры молекулы.
Исследования денатурации белков показало, что во многих случаях эта денатурация
является обратимой: даже после того как нативная структура белковой глобулы
полностью нарушается, и она переходит в свободно - сочлененное состояние, при
возвращении исходных условий восстанавливается и исходная структура.
Эти факты говорят о том, что во многих
случаях структура молекулы биополимера формируется в соответствии с принципом минимума
потенциальной энергии. Значит, среди структур, возможных при некоторых заданных
внешних условиях, имеется такая, которая обладает минимумом потенциальной
энергии. Именно в это состояние и переходит молекула, если внешние условия
зафиксированы, и имеется достаточно времени, чтобы совершился переход в это состояние.
Но тогда открывается возможность по
первичной структуре предсказывать вторичную и третичную структуры молекул биополимеров.
Для этого нужно, зная первичную структуру, найти такое пространственное
расположение мономерных звеньев, при котором потенциальная энергия будет
минимальна.
Отсюда следует, что предсказание
вторичной и третичной структур требует вычисления энергии конформации молекул.
Энергия
конформации зависит от нескольких факторов, среди которых важнейшими являются
следующие: углы поворота относительно связей, соединяющих мономерные звенья,
вандерваальсовы взаимодействия между сближенными в пространстве атомными
группировками, взаимодействия с молекулами растворителя, взаимодействия с
другими макромолекулами или низкомолекулярными соединениями (гормонами,
субстратами ферментативных реакций и т.д.).
В макромолекулах имеется множество
связей, вокруг которых возможны вращения, и тысячи группировок, могущих
взаимодействовать друг с другом. Расчет энергии возможных конформаций в этих
условиях - очень трудная задача.
Расчет конформации отдельного звена или
нескольких звеньев проще. Поэтому сначала рассчитывают энергию вторичной структуры,
а уже потом отдельные участки вторичной структуры укладывают в третичную
структуру так, чтобы энергия была минимальна.
Такой подход позволяет
предсказывать до 80% структуры у некоторых белков. Но в общем случае
предсказание высших уровней организации макромолекулы остается все еще трудной
задачей. Поэтому для предсказания того, как сворачивается, например, полипептидная
нить в третичную структуру используется информация о строении белков, первичная
структура которых известна. Накопление такой информации позволяет выявить
определенные закономерности формирования вторичной и третичной структур белков
и, тем самым, увеличить предсказуемость.
1.8. НАНОТЕХНОЛОГИИ
Предсказание третичной структуры
белков и нуклеиновых кислот имеет и большое прикладное значение. Ведь третичная
структура определяет функциональные возможности макромолекулы. Например, белки
обладают каталитической Функцией благодаря своей третичной структуре.
Рецепторные белки мембран также обязаны своей функцией третичной структуре.
В последние годы поиски путей
минитюаризации различных устройств
привели исследователей к молекулярному уровню. Сформировалась концепция
нанотехнологии. Согласно этой концепции дальнейший технический прогресс связан
с разработкой методов производства молекулярных устройств с заданными функциональными
возможностям.
Например, в настоящее время
ведутся работы по созданию молекулярных элементов памяти, переключателей для
вычислительных устройств молекулярных размеров. Другим направлением нанотехнологии
является создание различных высокочувствительных датчиков для регистрации
концентрации веществ, температуры, потока квантов и т. д.
Ясно, что физические основы
функционирования молекулярных устройств имеют свою специфику и поэтому
исследование механизмов функционирования таких устройств, созданных самой
природой, имеет важное значение для практики.
1.9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОПОЛИМЕРОВ
Самый мощный и информативный
метод исследования биополимеров - это рентгеноструктурный анализ (РСА). Суть
этого метода состоит в регистрации прошедших через кристалл исследуемого
вещества рентгеновских лучей и анализе полученной картины отражений этих лучей
от атомных плоскостей.
Длина волны рентгеновского
излучения сравнима с размерами кристаллической ячейки, то есть с расстояниями
между атомами в молекулах. По этому при прохождении рентгеновских лучей через
кристалл они отражаются от кристаллических плоскостей и интерферируют.
Интерференционная картина содержит информацию о расположении атомов в молекуле.
Используя метод РСА, Уотсон, Крик
и Уилкинс расшифровали структуру ДНК, Перутц получил трехмерную структуру
миоглобина. Эти работы были отмечены Нобелевской премией.
Для проведения РСА белок или нуклеиновую кислоту
необходимо закристаллизовать. При этом структура полимера оказывается зафиксированной.
Поэтому исследование динамических свойств структуры этим методом затруднительно.
Для этого используются другие методы.
Среди них важнейшее значение
имеют спектроскопические методы. Спектры поглощения и флуоресценции молекул в
видимой и ультрафиолетовой областях зависят от межмолекулярных взаимодействий
хромофорных группировок, входящих в состав молекулы. При изменении конформации
молекулы взаимодействие хромофорных группировок с другими частями молекулы
биополимера или молекулами растворителя (если хромофорная группировка находится
на поверхности макромолекулы) изменяется. Это приводит к изменению спектральных
характеристик хромофорных группировок - смещению максимума поглощения,
изменению интенсивности поглощения или испускания света и т.д. Регистрируя
изменения этих характеристик во времени, можно исследовать динамику конформационных
переходов.
В
последние годы разработаны новые спектроскопические методы исследования,
которые позволяют выявлять в молекулах белков и нуклеиновых кислот
спирализованные участки, 
участки. Например, метод дисперсии оптического
вращения (ДОВ) позволяет исследовать образование и разрушение спиральных
участков в белках. Физической основой метода является то, что при взаимодействии
плоскополяризованного света с оптически анизотропной структурой (а к таким
относятся и спирализованные участки) происходит вращение плоскости поляризации
света. Это явление называется оптической активностью.
Поскольку разные хромофорные
группировки дают вклад в ДОВ при различных длинах волн, измеряя ДОВ для
соответсвующих оптических переходов, можно определить конформацию отдельных
участков макромолекулы. Например, поглощение света белками в области 190 - 230
нм обусловлено пептидной связью. Спектры
ДОВ в этой области для 
спирали,
структуры
и неупорядоченного участка различны, что и позволяет по изменению спектра ДОВ
следить за изменением конформации полипептидного остова белковой молекулы.
Различные типы вторичной
структуры могут быть выявлены и с помощью спектроскопии в инфракрасной области
спектра (ИК - спектроскопии). Поглощение
электромагнитных волн в этой области спектра (длина волны от нескольких микрон
до миллиметров) обусловлено колебаниями атомов в молекуле. Частота этих колебаний
зависит от химических связей и межмолекулярных взаимодействий, в которых
участвуют атомы. 
например, наличие водородной связи –С=О…Н-N- в белках влияет на частоту валентных колебаний –С=О и
деформационных колебаний -N-H
групп. Поэтому по спектрам в инфракрасной области можно отличить и структуры
от статистического клубка (в котором водородные связи не образуются).
В последние годы для исследования
третичной структуры белков и нуклеиновых кислот используются
радиоспектроскопические методы: метод электронного парамагнитного резонанса
(ЭПР) и метод ядерного магнитного резонанса
(ЯМР). Физической основой этих методов является эффект расщепления
энергетических уровней электрона или ядра, имеющего ненулевой спин, в магнитном
поле (эффект Зеемана).
Неспаренный электрон в магнитном
поле может находиться на одном из двух энергетических уровней, соответствующих
двум возможным ориентациям электронного спина - по полю и против поля.
Расстояние между этими энергетическими уровнями определяется формулой:
где 
расстояние
между энергетическими уровнями
фактор
спектроскопического расщепления
напряженность
магнитного поля
Электромагнитные
волны с частотой, определяемой соотношением:
где 
постоянная
Планка
частота
электромагнитных волн
вызывают переходы
между этими двумя уровнями. Если переход происходит с нижнего уровня на
верхний, то энергия кванта поглощается.
Спектр ЭПР есть зависимость
интенсивности поглощения электромагнитной энергии образцом, помещенным в
магнитное поле, от напряженности этого поля.
По спектру ЭПР можно определить природу, концентрацию свободных
радикалов, характер их движения.
На основе метода ЭПР разработан новый
метод исследования молекул биополимеров, биомембран и других клеточных
структур, называемый методом спиновых меток. Суть этого метода состоит в
следующем: к молекуле биополимера прикрепляется ковалентной связью молекулярный
фрагмент, содержащий неспаренный электрон - метку - по спектру ЭПР которого
можно судить о микровязкости среды, в которой этот парамагнитный фрагмент
совершает броуновское вращение вокруг химической связи, которой он прикреплен к молекуле биополимера.
Если спиновая метка находится на
поверхности белковой глобулы, то микровязкость её окружения невелика, и она
может совершать быстрые вращения (что отражается на спектре ЭПР). Если же
спиновая метка находится в толще третичной структуры молекулы белка, то
микровязкость окружения велика и вращение заторможено.
При изменении конформации
белковой молекулы микровязкость окружения метки может измениться, что и
отразится на спектре ЭПР.
Спектры ЯМР молекул чувствительны
к влиянию различных атомных группировок на ядра, поглощающие электромагнитную
энергию. Поскольку при изменении конформации молекулы расстояния между атомными
группировками изменяются, влияния их друг на друга тоже изменяется. Поэтому
спектры ЯМР зависят от конформации молекулы биополимера. Изменение подвижности
атомных группировок также сказывается на спектрах ЯМР. Поэтому ЯМР используют
для исследования не только статической структуры, но и динамических
характеристик молекул биополимеров.
Поскольку ЯМР - спектроскопия позволяет
исследовать молекулы в растворе, появляется возможность изучать взаимодействие
биополимеров с различными физиологически активными соединениями и тем самым
выяснять механизмы их действия.
Одним, из
последних достижений в исследовании структуры биополимеров стало применение
туннельной микроскопии. Этот новый метод позволяет исследовать структуру
молекул биополимеров с атомным разрешением. Вероятно, в ближайшее время с
помощью туннельного микроскопа станет возможным "читать" первичные
структуры нуклеиновых кислот и белков.
Упомянутые в этом параграфе
физические методы исследования далеко не исчерпывают всего многообразия
используемых в экспериментальной практике приёмов. Детально ознакомиться с тем
или иным методом можно по соответствующим руководствам.
1.10. РОЛЬ КОНФОРМАЦИОННОЙ
ПОДВИЖНОСТИ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БЕЛКОВ
Конформационная подвижность
необходима для функционирования молекул биополимеров, двойная спираль ДНК
должна расплестись, чтобы могла быть считана информация, содержащаяся в ней.
Форма молекулы фермента должна изменяться в процессе взаимодействия с
субстратом, чтобы мог осуществиться каталитический акт. Это же справедливо для
белков, формирующих ионные каналы,
мембранных рецепторов, белков сократительного аппарата мышц.
Каков физический смысл конформационных
переходов в процессе выполнения белком своей функции?
Рассмотрим механизм мышечного
сокращения. Известно, что скольжение друг относительно друга актиновых и
миозиновых нитей сократительного аппарата вызывается изменением конформации
мостиков, посредством которых эти нити взаимодействуют друг с другом. В
состоянии покоя мостики образуют прямой угол с белковыми нитями. Гидролиз АТФ в
области контакта актина и миозина делает конформации мостика неустойчивой.
Мостик развивает усилие и нити скользят друг относительно друга.
В данном случае энергия гидролиза
АТФ преобразуется в механическую энергию через посредство конформационных переходов
в молекуле миозина. Следовательно, конформационный переход в молекуле миозина
является тем промежуточным звеном, которое осуществляет преобразование
химической энергии в механическую.
Другой пример, иллюстрирующий
роль конформационных переходов, - работа натриевого насоса. Транспорт ионов
натрия и калия через плазматическую мембрану осуществляется ферментом Nа,К-АТФазой. Этот интегральный белок плазматической мембраны
связывает на внутренней поверхности мембраны 3 иона Nа, что приводит к фосфорилированию ферментного белка. В результате этого
конформация молекулы становится неустойчивой, и происходит конформационный
переход. При этом 3 иона Na переносятся к внешней
поверхности мембраны и там десорбируются во внешний раствор. Их место занимают 2
иона К, что приводит к дефосфорилированию
белка. Происходит обратный конформационный переход, в результате которого
ионы К переносятся к внутренней поверхности
мембраны и там десорбируются в цитоплазму.
Таким образом, энергия АТФ
преобразуется в энергию градиента электрохимического потенциала ионов Na и К. Конформационный переход и в этом случае является
тем физическим процессом, который преобразует один вид энергии в другой.
Конформационные
переходы играют важную роль в ферментативном катализе. Субстрат и продукт
ферментативной реакции образуют с ферментом комплекс хотя и имеют, очень часто,
различную структуру. Это означает, что структура активного центра фермента
должна изменяться в процессе реакции.
Масштабы конформационных
перестроек в активном центре в процессе катализа невелики, но они надежно
регистрируются. различными физическими методами - по спектрам поглощения, спектрам
флуоресценции, методами ЭПР, ЯМР и другими.
Важное значение имеют конформационные переходы в
регуляции активности аллостерических ферментов. Аллостерические ферменты
изменяют свою каталитическую активность в ответ на связывание молекулы
модулятора в аллостерическом центре, который может находиться на значительном
удалении от активного центра. Это означает, что связывание регуляторной
молекулы в аллостерическом центре вызывает конформационный переход, изменяющий
структуру активного центра.
Многие ферменты имеют сложную
четвертичную структуру. Такие ферменты могут иметь кооперативную кинетику.
Кооперативность также предполагает участие конформационных переходов в
отдельных субъединицах и влияние этих переходов на структуру соседних
субъединиц.