ТЕМА
8. БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И
ОСОБЕННОСТИ
МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК КРОВИ
Содержание темы. Жизненный цикл эритроцита.
Эритропоэз, продолжительность жизни эритроцита. Факторы, приводящие к гибели эритроцитов.
Образование желчных пигментов. Роль микросомальной гем-оксигеназы в распаде гемоглобина.
Судьба глобина и гема. Образование билирубина. Прямой и непрямой билирубин.
Конъюгация билирубина с глюкуроновой кислотой в печени, механизм и значение. Стеркобилин
и уробилин.
Морфология
эритроцита. Биохимический состав и особенности метаболизма эритроцита.
Окисление гемоглобина в метгемоглобин, с образованием свободных радикалов
кислорода. Роль метгемоглобинредуктазы эритроцитов в восстановлении метгемоглобина.
Система
защиты гемоглобина и белков эритроцитов от свободнорадикального окисления. Роль
антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза,
глутатионредуктаза и др.) и низкомолекулярных антиоксидантов (НАДФН, глутатион,
аскорбат, a-токоферол и др.).
Лейкоциты.
Общая морфология и строение. Биохимический состав и особенности метаболизма.
Участие лейкоцитов в процессах фагоцитоза. Бактерицидные механизмы лейкоцитов.
Железосодержащие
соединения организма. Общее содержание железа в организме, уровень железа в
крови. Суточная потребность организма в железе. Механизмы всасывания железа в
кишечнике. Апоферритин и ферритин, их роль и структура. Транспорт железа в
крови, роль трансферрина. Депо железа. Ферритин и гемосидерин печени.
Вопросы для обсуждения
1.
Эритроциты.
Размер, формы. Функция эритроцитов. Показатели в норме у мужчин и женщин.
Образование и распад эритроцитов.
2.
Каковы
особенности структуры и состава мембраны эритроцитов?
3.
Какова
структура и роль цитоскелета эритроцитов?
4.
Каковы
пути обмена глюкозы в эритроците и их значение в метаболизме клетки?
5.
Каковы
пути предохранения гемоглобина от окисления? Механизмы участия глутатиона и
антиоксидантных ферментов в защите белков и липидов мембран эритроцитов от
окисления активными формами кислорода.
6.
Клетки,
выполняющие защитные функции. Классы лейкоцитов.
7.
Тромбоциты
или кровяные пластинки – роль в системе свертывания крови.
8.
Каковы
потребности организма в железе? Механизмы поглощения железа пищи, его транспорт
в крови и пути использования и депонирования.
Тестовые задания для
самоконтроля
|
1 |
Продолжительность жизни
эритроцитов составляет 1. 3-4 дня 2. 10-15 дней 3. 30-40 дней 4. 110-120 дней |
|
2 |
При деградации гема гемоглобина образуется
следующее вещество 1. Биливердин 2. Аминокислоты 3. NO 4. CO2 |
|
3 |
Деградация гема гемоглобина с
образованием CO, Fe2+ и биливердина осуществляется следующим
ферментом 1. Ксантиноксидазой 2. Ксантиндегидрогеназой 3. Микросомальной гем-оксигеназой 4. Биливердинредуктазой |
|
4 |
Биливердин, образующийся при
деградации гема, восстанавливается затем до
следующего вещества 1. Холестерина 2. Стеркобилина 3. Билирубина 4. Ксантина |
|
5 |
В гепатоцитах билирубин конъюгируется
со следующим веществом 1. Серной кислотой 2. Глицином 3. Глюкуроновой кислотой 4. Таурином |
|
6 |
Количество общего билирубина в
мкмоль/л в плазме крови может достигать следующих значений 1. До 2,7 2. До 17 3. До 10 4. До 20 |
|
7 |
Главным фосфатсодержащим
компонентом в эритроците является 1. Неорганический фосфат 2. 2,3-Дифосфоглицерат 3. АТФ 4. Глюкоза-6-фосфат |
|
8 |
В ретикулоците функционируют
следующие метаболические пути 1. Гликолитический путь 2. Синтез билирубина 3. Пентозофосфатный путь 4. Цикл трикарбоновых кислот |
|
9 |
Зрелый эритроцит получает энергию
главным образом за счёт следующих метаболических процессов 1. Цикла Кребса 2. Пентозофосфатного пути 3. Анаэробного гликолиза 4. Окисления жирных кислот |
|
10 |
Содержание ретикулоцитов в крови в
норме у взрослого человека составляет 1. 7% 2. 10% 3. 1% 4. 25% |
|
11 |
Аутоокисление Hb в MetHb приводит
к образованию следующей активной формы кислорода 1. Синглетного кислорода 2. Супероксидного аниона 3. Пероксида водорода 4. Гидроксильного радикала |
|
12 |
Главным низкомолекулярным (неферментным)
антиоксидантом эритроцитов является следующее вещество 1. Аскорбиновая кислота 2. Глутатион 3. Витамин Е 4. Убихинон |
|
13 |
Установите соответствие между антиоксидантными
ферментами эритроцитов и катализируемой реакцией 1. Супероксиддисмутаза 2. Каталаза 3. Глутатионпероксидаза 4. Глутатионредуктаза A.
Разлагает пероксид водорода Б. Разлагает перекись водорода при
участии глутатиона В. Удаляет супероксид анион Г. Восстанавливает окисленный
глутатион |
|
14 |
Установите соответствие между
соединениями железа в организме и их количеством 1. Гемоглобин 2. Миоглобин 3. Fe-содержащие ферменты 4. Железо запасов A. 3-5% Б. 0,1-0,2% В. 60-70% Г. 30-40% |
|
15 |
Суточная потребность организма в
железе составляет 1. 20-25 мг 2. 40-50 мг 3. 10-20 мг 4. 1-2 мг. |
Лабораторная работа №18
Метод количественного определения
содержания
восстановленного глутатиона в
эритроцитах
Общая
характеристика. Глутатион (GSH) – это трипептид
γ-глутамилцистеинилглицин (рис. 3).
Рис.
3. Строение глутатиона.
GSH
содержит необычную пептидную связь между аминогруппой цистеина и карбокси-группой
боковой цепи глутамата. Важность GSH
в клетке определяется его антиоксидантными свойствами. GSH не только защищает клетку от таких
токсичных агентов, как свободные радикалы, но и в целом определяет
редокс-статус внутриклеточной среды.
Концентрация GSH в
клетках составляет 1-10 мМ. Такая высокая концентрация GSH в
клетке способствует восстановлению любой дисульфидной связи (S-S), образующейся
между цистеинами цитозольных белков. При этом GSH превращается в окисленную
форму GSSG. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента
глутатионредуктазы, которая постоянно находится в клетке в активном состоянии и
индуцируется при оксидативном стрессе. Отношение GSH/GSSG внутри клетки является одним
из важнейших параметров, который показывает уровень оксидативного стресса.
Принцип
метода: Восстановленный глутатион реагирует с 5,5ʹ-дитиобис
(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБК) (реагент Эллмана) (рис. 4) с образованием
сложного соединения, которое обладает максимумом поглощения при 412 нм.
Рис. 4. Химическая структура реактива Эллмана.
Исследуемый
материал (образец). Количество GSH определяют в
эритроцитах.
Реактивы.
1. 30% трихлоруксусная кислота (ТХУ). Растворить 30 г ТХУ в дистиллированной
воде и довести объем до 100 мл.
2. 0,3 М трис-HCl буфер рН 8,8
Растворить 36,33 г трис(гидроксиаминометан) в 0,99 л дистиллированной воды, рН
довести путем добавления по каплям концентрированной НСl ( ≈ 7 мл 36%
НСl). Объем довести до 1 л.
3. 10 мМ реактив Эллмана на
метаноле. 3,96 мг реагента Эллмана растворить в метаноле и довести до 1 мл.
Реактив стабилен 2 недели при хранении +4ºС в сосуде с плотно закрытой
крышкой.
4. Стандартные растворы GSH для
калибровки 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 ммоль/л.
Ход определения
К 1 мл эритроцитов добавьте 0,2 мл
30% ТХУ, перемешайте. Через 10 мин пробу центрифугируйте при 3000 об/мин в
течение 10 мин. К 1 мл надосадочной жидкости добавьте 2,5 мл буфера и 0,05 мл
реактива Эллмана. Холостая проба содержит 3,5 мл буфера и 0,05 мл реактива
Эллмана. Пробы перемешайте и оставьте на 10 мин для развития окраски и фотометрируйте
пробы при λ = 412 нм относительно дистиллированной воды (контроль) в
кювете с длиной оптического пути 1 см.
Расчет концентрации. Расчет концентрации GSH
производите по формуле:
С (ммоль/л) =
Еоп×F×1,2×1000
где С – концентрация GSH в ммоль на 1 л эритроцитов; Еоп –
оптическая плотность опытной пробы, F – фактор пересчета; 1,2 – объем пробы после добавления
ТХУ; 1000 – объем эритроцитов, мл.
Фактор пересчета
находят из калибровочной кривой, для построения которой используйте растворы
восстановленного глутатиона с концентрациями от 0,02 до
Нормальные показатели. Содержание GSH, определенное описанным способом, у практически
здоровых взрослых людей составляет 2-3 ммоль/л.
ЗАДАНИЕ
1. Определите содержание GSH в эритроцитах человека и крысы.
2. Сделайте вывод.
|
|
|
|
|
|
|
|
Лабораторная работа №19
Определение активности каталазы в
крови
Принцип
метода. Об активности фермента судят по скорости убыли перекиси
водорода в среде инкубации. Концентрацию перекиси водорода определяют по
реакции с молибдатом аммония, который дает стойкий окрашенный комплекс.
Исследуемый
материал (образец). Кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином
(200 Ед/мл) и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Плазму отбирают,
а эритроциты трижды отмывают холодным физ.раствором, каждый раз центрифугируя
при тех же оборотах в течение 5 мин. Отмытые эритроциты гемолизируют, для чего
к 0,3 мл упакованных эритроцитов с помощью пипетки сильной струей приливают 2,7
мл охлажденной бидистиллированной воды. Гемолизат периодически встряхивают в
течение 5 мин, а затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин для
осаждения стромы и неразрушенных клеток. Прозрачный гемолизат сливают в стоящую
на льду пробирку и используют как для определения активности каталазы, так и
для определения концентрации гемоглобина.
Реактивы.
1. 0,9%-ный
раствор хлорида натрия.
2. 4%-ный
раствор молибдата аммония.
3. 10%-ный
раствор серной кислоты.
4. 0,034%-ный
раствор перекиси водорода.
Все реактивы
готовят на бидистиллированной воде.
Ход анализа
Перед работой полученный 10%-ный
гемолизат разбавьте в 25 раз (0,1 мл гемолизата + 2,4 мл воды) и используйте в
качестве источника фермента.
Инкубационная среда включает 2 мл
0,034%-ной перекиси водорода и 0,04-0,05 мл 0,1%-ного гемолизата.
В пробирки разлейте по 2 мл
перекиси водорода и предварительно инкубируйте в течение 5 мин при 25°С. Затем
в каждую пробирку внесите по 0,05 мл гемолизата. В контрольную пробирку вместо
ферментативного препарата внесите такое же количество воды. Пробы инкубируйте в
течение 2 мин при 25°С. По истечении времени реакцию остановите добавлением 1
мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Оптическую плотность проб измерьте при
длине волны 410 нм в кювете с длиной оптического пути
Расчет
концентрации. Об активности каталазы судят по степени
уменьшения оптической плотности в опытных пробах (Ео) по сравнению с контрольной (Ек):
Стандартная проба (Ест):
1,0 мл 0,1%-ного раствора перекиси водорода доведите до 5 мл дистиллированной
водой. Затем в пробирку внесите 1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Пробы
инкубируйте при 24°С 10 мин, а затем оптическую плотность измерьте при длине
волны 410 нм против воды.
Активность фермента (Акат, мкмоль Н2О2/мг
Hb/ мин) рассчитайте по формуле:
,
где
34 – молекулярная масса перекиси водорода; t
– время протекания реакции, мин; С –
концентрация гемоглобина в пробе, мг; F
–
фактор пересчета значений оптической плотности в мг перекиси водорода
(рассчитывают по калибровочному графику).
Построение
калибровочной кривой. Предварительно приготовьте 0,1%-ный
раствор перекиси водорода. Затем разбавьте его водой, как указано ниже (табл.
19).
Таблица 19.
Схема
приготовления стандартных растворов перекиси водорода.
|
№ пробирки |
0,1%-ный раствор перекиси водорода, мл |
Дистиллированная
вода, мл |
Концентрация перекиси водорода в 5 мл
раствора, мг |
|
1 |
0,25 |
4,75 |
0,25 |
|
2 |
0,5 |
4,50 |
0,5 |
|
3 |
1,0 |
4,0 |
1,0 |
|
4 |
1,5 |
3,5 |
1,5 |
|
5 |
2,0 |
3,0 |
2,0 |
|
6 |
2,5 |
2,5 |
2,5 |
Из каждой пробирки (№ 1-6) отберите по 2 мл разбавленного
раствора перекиси водорода и перенесите в сухие пробирки (№ 1-6). При этом содержание
перекиси водорода в пробирках будет: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мг. Затем в
каждую пробирку внесите 1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Пробы
инкубируйте при 24°С 10 мин, а затем оптическую плотность измерьте при длине
волны 410 нм против воды. По полученным данным постройте калибровочную кривую,
которую используйте в дальнейшем для расчета активности каталазы.
Концентрацию гемоглобина в гемолизате определите как
описано в работе №20.
ЗАДАНИЕ
1. Определите активность каталазы в
гемолизатах.
2. Сделайте вывод.
|
|
|
|
|
|
|
|