ТЕМА 5. НЕБЕЛКОВЫЕ АЗОТИСТЫЕ КОМПОНЕНТЫ
КРОВИ
Общая
характеристика азотистых компонентов плазмы крови. Остаточный азот. Азотемии.
Ретенционная и продукционная азотемии. Характеристика отдельных низкомолекулярных
азотсодержащих компонентов плазмы крови: мочевина, креатин, креатинин, мочевая
кислота, индикан, аммиак, полипептиды и аминокислоты.
Вопросы для обсуждения
1.Вещества,
относящиеся к небелковым азотистым компонентам крови.
2.
Остаточный азот – важный показатель обмена веществ в организме. Содержание
остаточного азота в норме.
3.
Азотемия и её виды.
4. Мочевина –
как главный продукт обмена белков. Вспомните реакции цикла мочевины.
5. Концентрация мочевины в сыворотке крови. Содержание
мочевины в сыворотке крови, прежде всего, зависит от интенсивности синтеза
мочевины в печени и выделения ее почками. Назовите причины повышения и
понижения уровня мочевины в крови.
6. Креатин – синтезируется в почках и печени, в мышцах
превращается в креатинфосфат – источник энергии для процессов мышечного сокращения.
При заболеваниях мышечной системы содержание креатина в крови значительно возрастает.
Концентрация креатина в
сыворотке крови.
7. Креатинин – конечный продукт азотистого обмена, образуется в
результате дефосфорилирования креатинфосфата в мышцах, выводится из организма
почками. Содержание креатинина в крови снижается при заболеваниях мышечной
системы, повышается при почечной недостаточности. Концентрация креатинина в сыворотке крови. О чем говорит
увеличение креатинина в сыворотке крови?
8. Мочевая
кислота – конечный
продукт метаболизма пуриновых оснований, входящих в состав нуклеотидов (РНК и
ДНК) и нуклеопротеидов. Мочевая кислота синтезируется в основном в печени и
полностью выводится с мочой. Концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови. Назовите причины повышения и понижения уровня мочевой
кислоты в крови.
9. Индикан – продукт обезвреживания индола,
образуется в печени, выводится почками. Содержание его в крови в норме.
Причины, при которых снижается и повышается его уровень в крови.
10. Аммиак образуется при дезаминировании
азотистых соединений, в основном аминокислот, пуриновых, пиримидиновых
нуклеотидов и др. Обезвреживание аммиака. Связывание с глутаминовой и
аспарагиновой кислотами с образованием амидов. Выведение в виде аммонийных
солей.
11. Полипептиды поступают при переваривании
белков и распаде тканевых белков. Причины увеличения количества полипептидов.
12. Аминокислоты (экзогенные и эндогенные). Аминокислоты
плазмы – глутаминовая кислота и глутамин. Содержание аминокислот. Клиническое
значение определения аминокислот и аминного азота, гипераминоацидемия.
Тестовые задания для
самоконтроля
|
1 |
В состав остаточного азота крови входят следующие вещества 1. Глюкоза 2. Ацетоуксусная кислота 3. Мочевина 4. Ацетилхолин |
|
2 |
Величина остаточного азота у
взрослого здорового человека равна следующей величине 1. 10-12 ммоль/л 2. 30-36 ммоль/л 3. 14-28 ммоль/л 4. 6-10 ммоль/л |
|
3 |
Повышение содержания небелкового азота
называется 1. Уремия 2. Азотемия 3. Урикемия 4. Лейкопения |
|
4 |
Повышение содержание небелкового азота (азотемия) в
основном зависит от содержания в крови следующего вещества 1. Аммиака 2. Мочевины 3. Креатинина 4. Мочевой кислоты |
|
5 |
Установите соответствие между различными формами азотемии
и причинами, приводящими к ней 1. Ретенционная азотемия 2. Продукционная азотемия A. Обусловлена избыточным поступлением в кровь продуктов
распада тканевых белков. Функция почек при этом не нарушена B. Наступает в
результате недостаточного выделения с мочой азотсодержащих веществ при
нормальном поступлении их в кровь |
|
6 |
Нормальное содержание мочевины
(ммоль/л) в крови составляет следующую величину 1. 2,5-8,3 2. 1,4-2,5 3. 0,2-0,3 4. 0,24-0,5 |
|
7 |
Содержание креатина (в мкмоль/л) в
плазме крови составляет следующую величину 1. 76-114 2. 220-300 3. 65-106 4. 150-200 |
|
8 |
Содержание креатинина (в мкмоль/л)
в плазме крови составляет следующую величину 1. 150-200 2. 65-106 3. 220-300 4. 76-114 |
|
9 |
По нарастанию концентрации
креатинина в крови можно определять степень хронической недостаточности
следующего органа 1. Печени 2. Сердца 3. Почек 4. Поджелудочной железы |
|
10 |
Мочевая кислота является конечным продуктом
обмена следующих веществ 1. Пиримидиновых оснований 2. Пуриновых оснований 3. Циклических аминокислот 4. Полипептидов |
|
11 |
Уровень мочевой кислоты (в
ммоль/л) в плазме крови женщин составляет следующую величину 1. 0,24-0,5 2. 0,08-0,1 3. 0,16-0,40 4. 2,5-8,3 |
|
12 |
Повышение концентрации мочевой
кислоты является главным симптомом следующей патологии 1. Гепатита 2. Сахарного диабета 3. Подагры 4. Панкреатита |
|
13 |
Содержание индикана (в мкмоль/л) в
крови здорового человека составляет следующую величину 1. 2,5-8,3 2. 40-80 3. 9,0-11,6 4. 1,0-4,7 |
|
14 |
Содержание аммиака в плазме (в
мкмоль/л) составляет следующую величину 1. 8,5 2. 11,6 3. 20,4 4. 18,2 |
|
15 |
Установите соответствие между компонентами
крови и распределением азота аминокислот 1. В плазме крови 2. В эритроцитах A. 50-80 мг/л Б. 80-100 мг/л |
Лабораторная работа №10
Определение содержания мочевины в
сыворотке крови
Принцип
метода. Мочевина образует с диацетилмонооксимом, в
присутствии тиосемикарбазида и трехвалентного железа, окрашенные соединения,
интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации мочевины в пробе.
Исследуемый
материал. Сыворотка крови.
Состав
набора.
1. Реагент № 1. Раствор
диацетилмонооксима –
2. Реагент № 2. Раствор серной
кислоты –
3. Реагент № 3. Раствор
тиосемикарбазида гидрохлорида –
4. Реагент № 4. Железо хлорное –
5. Калибратор – раствор мочевины –
8,33 ммоль/л (5 мл).
Подготовка
реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Рабочий
реагент. Смешайте реагенты в следующей последовательности: №1 – 10 мл, №2 – 10
мл, №3 – 2 мл и №4 – 0,4 мл; немедленно добавьте 58 мл воды и перемешайте.
Рабочий реагент стабилен в течение рабочего дня.
Ход анализа
Компоненты реакционной смеси
внесите в пробирки вместимостью 10 мл в количествах, указанных в табл. 8.
Таблица 8
|
Состав проб |
Опытная проба |
Калибровочная проба |
Контрольная проба |
|
Рабочий реагент, мл |
2,00 |
2,00 |
2,00 |
|
Исследуемая проба, мл |
0,01 |
– |
– |
|
Калибратор, мл |
– |
0,01 |
– |
|
Вода
дистиллированная, мл |
– |
– |
0,01 |
Пробы тщательно перемешайте,
закройте пробирки колпачками из алюминиевой фольги или стеклянными каплями и инкубируйте
точно 10 мин на кипящей водяной бане. После окончания инкубации пробы охладите
под проточной водой, и измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной
проб против контрольной пробы при длине волны 510 (490-540) нм в кювете с
толщиной поглощающего свет слоя 5 мм. Окраска стабильна 15 мин после окончания
инкубации.
Расчет
концентрации мочевины в исследуемом образце
проведите по формуле:
,
где С – концентрация мочевины в
опытной пробе, ммоль/л; Е пробы –
оптическая плотность опытной пробы; Е
калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы; 8,33 – концентрация
мочевины в калибровочном растворе, ммоль/л.
Нормальные
показатели: 2,5-8,3 ммоль/л.
ЗАДАНИЕ
1. Определите содержание мочевины в
сыворотке крови человека и крысы.
2. Сделайте вывод.
|
|
|
|
|
|
|
|
Лабораторная работа №11
Определение содержания мочевины в
плазме крови уреазным
фенол/гипохлоритным методом
Принцип
метода. Мочевина под действием уреазы гидролизуется с
образованием карбоната аммония. Ионы аммония реагируют в присутствии
нитропруссида с фенолом и гипохлоритом, образуя окрашенный комплекс.
Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины в пробе.
Исследуемый
материал. Свежая сыворотка (плазма) крови без следов
гемолиза (недопустимо использовать в качестве антикоагулянта оксалат).
Состав
набора.
1. Реагент №1 (раствор уреазы):
уреаза – 10 Ед/мл, фосфатный буфер, рН 7,0 – 50 ммоль/л, стабилизаторы.
2. Реагент №2. Калибратор: мочевина
– 5 ммоль/л (30 мг/100 мл).
3. Реагент №3
(фенол/нитропруссидный реагент): фенол – 106 ммоль/л, нитропруссид натрия –
0,17 ммоль/л.
4. Реагент №4 (гипохлорит):
гипохлорит натрия – 11 ммоль/л, натрий едкий – 125 ммоль/л.
Приготовление
рабочего реагента. Все реагенты готовы к использованию.
Ход
анализа
Компоненты реакционной смеси
внесите в пробирки вместимостью 10 мл в количествах, указанных в табл. 9.
Таблица 9
|
Состав пробы |
Опытная проба |
Калибровочная проба |
Контрольная проба |
|
Плазма (сыворотка),
мл |
0,01 |
– |
– |
|
Реагент №1, мл |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
|
Реагент №2,
Калибратор, мл |
– |
0,01 |
– |
|
Вода
дистиллированная, мл |
– |
– |
0,01 |
Пробы тщательно перемешайте и инкубируйте
в течение 5-10 мин при температуре 20-25°С. Затем в каждую пробу добавьте Реагент
№3 и №4 в последовательности, указанной в табл. 10.
Таблица 10
|
Добавляемые в пробу реагенты |
Опытная проба |
Калибровочная проба |
Контрольная проба |
|
Реагент №3, мл |
1 |
1 |
1 |
|
Реагент №4, мл |
1 |
1 |
1 |
После перемешивания пробы инкубируйте
в течение 15 мин при 37°С в термостате. После окончания инкубации пробы
охладите под проточной водой, и измерьте оптическую плотность опытной и
калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 540 (490-600) нм в
кювете с толщиной поглощающего свет слоя 5 мм. Окраска стабильна 5-8 часов
после окончания инкубации.
Расчет
концентрации (С) мочевины в исследуемом образце
проведите по формуле:
,
где С – концентрация мочевины в
опытной пробе, ммоль/л; Е пробы –
оптическая плотность опытной пробы, Е
калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы; 5 ммоль/л –
концентрация мочевины в калибровочном растворе.
Нормальные
показатели: 2,5-8,3 ммоль/л.
ЗАДАНИЕ
1. Определите содержание мочевины в
сыворотке крови человека и крысы.
2. Сделайте вывод.
|
|
|
|
|
|
|
|
Лабораторная работа №12
Количественное определение содержания
креатинина в сыворотке крови
Принцип
метода.
Креатинин при взаимодействии с пикриновой кислотой в щелочной среде образует
окрашенные соединения (реакция Яффе –
образование таутомера пикрата креатинина), интенсивность окраски
которых пропорциональна концентрации креатинина в сыворотке крови.
Исследуемый материал: сыворотка крови.
Реактивы: калибратор, стандартный раствор креатинина
(177 мкмоль/л), 2%-ный раствор пикриновой кислоты, 10%-ный раствор NaOH, 5%-ный
раствор ТХУ, дистиллированная вода.
Ход работы
В
трех пробирках смешайте реактивы по схеме (табл. 11):
Таблица
11
|
Состав проб |
Опытная
проба |
Калибровочная проба |
Контрольная
проба |
|
Сыворотка, мл |
0,5 |
– |
– |
|
Дистиллированная вода, мл |
– |
– |
1,5 |
|
ТХУ, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Стандартный раствор, мл |
– |
0,5 |
– |
Через 5 мин опытную пробу и стандартную пробы центрифугируйте при
3000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость используйте для подготовки
следующих проб (табл. 12):
Таблица
12
|
Состав проб |
Опытная
проба |
Калибровочная проба |
Контрольная
проба |
|
Надосадочная жидкость, мл |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
|
Пикриновая кислота, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
NaOH, мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Перемешайте и через 20 мин колориметрируйте опытную и
калибровочную пробы при зеленом светофильтре (540 нм) в кювете толщиной 0,5 см
против контроля.
Расчет концентрации (С) креатинина в исследуемом образце
проведите по формуле:
,
где С – концентрация креатинина в сыворотке крови в мкмоль/л;
177 – концентрация креатинина в калибраторе,
Аоп – оптическая плотность
опытной пробы; Аст – оптическая плотность калибровочной пробы.
Норма креатинина в сыворотке
крови – 53-106 мкмоль/л.
Лабораторная
работа №13
Количественное
определение содержания мочевой кислоты в крови
Принцип
метода. Определение основано на проведении сопряженных
реакций, катализируемых уриказой и пероксидазой. Мочевая кислота под действием
фермента уриказы окисляется до аллантоина, перекиси водорода и двуокиси углерода.
Образующаяся в данной реакции перекись водорода при участии фермента
пероксидазы способствует окислительному азосочетанию
3,5-дихлоргидрокси-2-бензенсульфоната (DCHBS) и 4-аминоантипирина (4-ААП) с
образованием окрашенного соединения (хинонимин).
Схема
реакции:
Интенсивность
окраски реакционной среды пропорциональна содержанию мочевой кислоты в
исследуемом материале и определяется фотометрически при длине волны 500 нм
(490-540 нм).
Исследуемый
материал. Негемолизированная сыворотка или плазма крови.
Состав
набора.
1.
Реагент 1. Буфер: фосфат – 150 ммоль/лМ, 3,5-дихлоргидрокси-2-бензенсульфоната
(DCHBS) – 2,5 ммоль/л.
2.
Реагент 2. Лиофилизат: уриказа – 30 Ед/л, аскорбатоксидаза – 250 Ед/л, пероксидаза
– 250 Ед/л, 4-аминоантипирин – 0, 25 ммол/л.
3.
Калибратор: калибровочный раствор мочевой кислоты с концентрацией 357 мкмоль/л,
альбумин – 50 г/л.
Подготовка
реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Содержимое
одного флакона с Реагентом 2 растворите в 50 мл Реагента 1 при аккуратном
перемешивании. Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать
рабочий реагент после растворения лиофилизата в течение 1 ч при комнатной
температуре +18-25°С.
Рабочий реагент стабилен при +2-8°С
в защищенном от света месте в плотно закрытом флаконе не менее 3-х недель.
Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!
Ход анализа
Компоненты реакционной среды
внесите в пробирки в соответствии с табл. 13.
Таблица 13
|
Состав проб |
Опытная проба |
Калибровочная проба |
Контрольная проба |
|
Рабочий реагент, мл |
4,00 |
4,00 |
4,00 |
|
Исследуемый образец,
мл |
0,1 |
– |
– |
|
Калибратор, мл |
– |
0,1 |
– |
|
Вода
дистиллированная, мл |
– |
– |
0,1 |
Объемы исследуемого образца и
рабочего реагента можно изменить, соблюдая соотношение 1:40.
Содержимое пробирок тщательно перемешайте
и инкубируйте 7 мин при 18-25°С или 5 мин при 37°С. Измерьте оптическую
плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы при
длине волны 500 (490-540) нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Окраска
растворов стабильна в течение 40 мин после окончания инкубации.
Расчет
концентрации (С, мкмоль/л) мочевой пробы в
исследуемом образце производите по формуле:
,
где С – концентрация мочевой
кислоты в мкмоль/л; Е пробы –
оптическая плотность опытной пробы; Е
калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы; 357 мкмоль/л –
концентрация мочевой кислоты в калибраторе.
Нормальные
показатели – у мужчин 202-416 мкмоль/л, у женщин 142-339
мкмоль/л.
ЗАДАНИЕ
1. Определите содержание мочевой
кислоты в сыворотке (плазме) крови крыс.
2. Сделайте вывод.
|
|
|
|
|
|