ТЕМА 4. ФЕРМЕНТЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ИХ

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ РОЛЬ

 

Содержание темы. Клиническая ферментология. Общая характеристика ферментопатий. Ферментодиагностика. Типы ферментов: клеточные, секреторные и экскреторные ферменты. Типы изменения активности ферментов при различных видах патологии. Гипоферментемия, гиперферментемия, дисферментемия. Основные цели определения активности ферментов в клинической практике. Характеристика наиболее часто исследуемых в клинической практике ферментов: аминотрансферазы, лактатдегидрогеназа, креатинкиназа, гаммаглутамилтранспептидаза, фосфатазы, протеиназы и антипротеиназы. Роль ферментов сыворотки крови в диагностике инфаркта миокарда, патологии печени и желчевыводящих путей, заболеваний поджелудочной железы и др. болезней.

 

Вопросы для обсуждения

 

1. Ферменты плазмы крови.

2. Классификация ферментов плазмы крови и их характеристика. Универсально распространенные (АсТ, АлТ, ЛДГ и др.) и органоспецифические, или тканеспецифические (КК, ФМФ-А и др.) ферменты.

3. Ферменты: секреторные, экскреторные, индикаторные.

4. Ферментодиагностика. Основные ферменты, которые используются в клинической диагностике. Дис-, гипо-, гиперферментемии.

5. Механизмы регуляции активности ферментов.

 

 

Тестовые задания для самоконтроля

 

1

Установите соответствие между ферментами сыворотки крови и их характеристиками

1. Секреторные

2. Клеточные

3. Экскреторные

A. Попадают в кровь из тканей в результате физиологического старения или отмирания клеток

Б. Физиологическая функция этих ферментов реализуется непосредственно в крови

В. Образуются некоторыми пищеварительными железами

 

2

В группу секреторных входит следующий фермент

1. Лактатдегидрогеназа

2. Гексокиназа

3. Лецитин-холестерин-ацилтрансфераза

4. Фумараза

 

3

Уровень содержания отдельных клеточных ферментов в крови не зависит от

1. Концентрации их в тканях

2. Молекулярной массы

3. Скорости синтеза в печени

4. Топографии в клетке и периода полужизни

 

4

Аланинаминотрансфераза является маркерным ферментом для

1. Сердца

2. Печени

3. Почек

4. Поджелудочной железы

 

5

Аспартатаминотрансфераза является маркерным ферментом для

1. Поджелудочной железы

2. Почек

3. Печени

4. Сердца

 

6

Расположите органы в порядке убывания в них активности аспартатаминотрансферазы

1. Скелетные мышцы

2. Миокард

3. Печень

4. Головной мозг

5. Почки

 

7

Расположите органы в порядке убывания в них активности аланинаминотрансферазы

1. Сердце

2. Скелетные мышцы

3. Печень

4. Поджелудочная железа

 

8

Кислая фосфатаза сосредоточена преимущественно в

1. Костной ткани

2. Предстательной железе

3. Миокарде

4. Печени

 

9

Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови увеличивается при следующих заболеваниях

1. Механической желтухе

2. Заболеваниях костного скелета

3. Циррозе печени

4. Инфаркте миокарда

5. Раке предстательной железы

 

10

Установите соответствие между тканью и изоформами лактатдегидрогеназы

1. Миокард

2. Почки и эритроциты

3. Легкие

4. Скелетные мышцы

5. Печень

A. ЛДГ2

Б. ЛДГ5

В. ЛДГ3

Г. ЛДГ5, ЛДГ4, ЛДГ3

Д. ЛДГ1

 

11

Установите соответствие между тканями и изоформами креатинкиназы

1. Мозг

2. Скелетная мускулатура

3. Миокард

A. ММ

Б. МВ, ММ

В. ВВ

12

При паренхиматозных повреждениях тканей печени (инфекционный гепатит) в сыворотке крови резко возрастают изоформы следующего фермента

1. ЛДГ1

2. Лейцинаминопептидазы

4. ЛДГ5 и ЛДГ4

5. Аланинаминопептидазы

 

13

Индикаторами поражения указанных тканей являются следующие ферменты крови

1. Костного скелета

2. Поджелудочной железы

3. Почек

A Трипсин, кининоген, эластаза, a-амилаза, липаза

Б. Щелочная фосфатаза

В. Сукцинатдегидрогеназа, лизоцим, урокиназа

 

14

В группу секреторных входит следующий фермент

1. Лактатдегидрогеназа

2. Лецитин-холестерин-ацилтрансфераза

3. Постгепариновая (печёночная) липопротеидлипаза

4. Холинэстераза

 

15

Уровень содержания отдельных клеточных ферментов в крови зависит от

1. Концентрации их в тканях

2. Молекулярной массы

3. Скорости синтеза в печени

4. Топографии в клетке и периода полужизни

 

 

Лабораторная работа №8

 

Количественное определение активности

аспартатаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови

энзиматическим кинетическим методом

 

Принцип метода. Под действием фермента аспартатаминотрансферазы (АСТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции оксалоацетат при участии фермента малатдегидрогеназы (МДГ) и кофермента НАДН превращается в малат.

Схема реакции:

 

 

 

 

 

Скорость окисления НАДН в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности аспартатаминотрансферазы.

Исследуемый материал. Свежая негемолизированная сыворотка или плазма крови. Активность АСТ в сыворотке или плазме крови снижается после 3-х дней хранения: при +2-8°С на 10%, при +18-25°С на 17%.

Состав набора.

Реагент 1 (буфер-субстратный раствор).

Реагент 2 (фермент-кофакторная смесь (лиофилизат)).

Реагент 3 (стартовый реагент).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Перед проведением анализа содержимое одного флакона с Реагентом 2 растворите в содержимом одного флакона с Реагентом 1 при аккуратном перемешивании. Рабочий реагент готов к применению через 20 мин после растворения. Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!

 

Ход анализа

 

Исследование проводите непосредственно в термостатируемой при +37°С фотометрической кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 340 нм против воздуха или воды. Смешайте 3 мл рабочего реагента и 0,3 мл анализируемого материала. Через 1 минуту добавьте 0,3 мл стартового реагента, тщательно перемешайте и через 1 мин считывайте величины экстинкции с интервалом в 1 мин в течение 3-х мин. Вычислите среднее изменение экстинкции за 1 мин (ΔЕ/мин).

Расчет концентрации. Активность фермента АСТ (А, Ед/л) рассчитайте по формуле:

 

А=1905ΔЕ340нм/мин

 

где: 1905 – фактор пересчета, в Ед/л; ΔЕ340нм/мин – среднее значение изменения экстинкции за минуту. Если ΔЕ/мин при запуске реакции образцом превышает 0,100 оптических единиц, разведите исследуемый образец физиологическим раствором в 10 раз и повторите анализ; результат умножьте на фактор разведения 10.

Нормальные величины активности АСТ в сыворотке или плазме крови у мужчин – от 10 до 37 Ед/л, у женщин – от 10 до 31 Ед/л.

 

ЗАДАНИЕ

1. Определите активность АСТ в сыворотке или плазме крови человека и крысы.

2. Сделайте вывод.

 

 

 

 

 

 

Лабораторная работа №9

 

Количественное определение активности

аланинаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови

оптимизированным кинетическим энзиматическим методом

 

Принцип метода. Под действием фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции пируват при участии фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и кофермента НАДН превращается в лактат. Скорость окисления НАДН в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности АЛТ.

Схема реакции:

 

 

 

 

 

Исследуемый материал. Свежая негемолизированная сыворотка или плазма крови. Активность АЛТ в сыворотке или плазме крови снижается после 3-х дней хранения: при +2-8 °С на 10%, при +18-25°С на 17%.

Состав набора. Реагент 1. Буфер, рН 7,5, включающий трис, 100 ммоль/л; L-аланин, 500 ммоль/л; α-кетоглутарат, 15 ммоль/л; натрия азид, 0,03% – 1 флакон (50 мл) или 2 флакона (по 50 мл)

Реагент 2. Лиофилизированная смесь (конечная концентрация в рабочем реагенте: ЛДГ, 1300 ед/л; НАДH, 0,18 ммоль/л; натрия азид, 0,03%; бычий сывороточный альбумин, 1 г/л) – 1 или 2 флакона.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Перед проведением анализа смешайте необходимые количества Реагента 1 и Реагента 2 в соотношении 4:1. Рабочий реагент стабилен при +2-8°С в защищенном от света месте в плотно закрытом флаконе в течение 48 часов.

Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!

 

Ход анализа

 

Исследование проводите непосредственно в термостатируемой при +37°С фотометрической кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 340 нм против воздуха или воды.

Запуск реакции образцом: Смешайте 3 мл предварительно прогретого рабочего реагента и 0,3 мл анализируемого материала (соотношение 10:1). Через 1 мин начните считывание величины экстинкции с интервалом в 1 мин в течение 3-х мин. Вычислите среднее изменение экстинкции за 1 мин (ΔЕ/мин).

Расчет концентрации. Активность фермента (А, Ед/л) рассчитайте по формуле:

 

А=1746ΔЕ340нм/мин,

 

где А – активность АЛТ в Ед/л; ΔЕ340нм – среднее значение изменения экстинкции за минуту; 1746 – фактор пересчета в Ед/л.

Если ΔЕ/мин при запуске реакции образцом превышает 0,110 единиц оптической плотности, разведите исследуемый образец физиологическим раствором в 10 раз и повторите анализ; результат умножьте на фактор разведения 10.

Нормальные величины активности АЛТ в сыворотке или плазме крови у мужчин – от 10 до 40 Ед/л, у женщин – от 10 до 31 Ед/л.

 

ЗАДАНИЕ

 

1. Определите активность АЛТ в сыворотке или плазме крови человека и крысы.

2. Сделайте вывод.