ТЕМА 2. БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ

 

Содержание темы. Общие свойства и функции белков плазмы. Содержание белков в плазме. Питательная, транспортная, буферная функции белков плазмы. Белки плазмы как неспецифические переносчики. Роль белков в создании коллоидно-осмотического давления. Участие белков в предупреждении кровопотерь.

Классификация белков плазмы. Характеристика отдельных белковых фракций плазмы крови. Структура и функции сывороточного альбумина. Глобулины и их классификация. Характеристика наиболее изученных белков глобулиновой фракции. a1-глобулины: a1-гликопротеид кислый, a1-антитрипсин, a1-фетоглобулин, тироксинсвязывающий белок, транскортин.

a2-Глобулины: церуллоплазмин, гаптоглобин, a2-макроглобулин.

b-Глобулины: трансферрин, гемопексин, С-реактивный белок, b2-микроглобулин.

g-Глобулины. Структура, роль

 

Вопросы для обсуждения

 

1. Белки плазмы крови и их классификация.

2. Функции белков плазмы крови.

3. Синтез белков плазмы крови в печени, ретикулоэндотелиальной системе, клетками иммунной системы.

4. Общий белок в сыворотке крови, гипо- и гиперпротеинемии.

5. Методы определения содержания общего белка в крови.

6. Общая характеристика основных белковых фракций: альбумины, глобулины, фибриноген.

7. Альбумин, гипо- и гиперальбунемия.

8. α1-Глобулины. Биологическая роль и диагностическое значение α1-протеиназного ингибитора, α1-кислого гликопротеина.

9. α2-Глобулины. Биологическая роль и диагностическое значение α2-макроглобулина, гаптоглобина, церулоплазмина.

10. β-глобулины. Биологическая роль и диагностическое значение трансферрина и гемопексина.

11. γ-Глобулины. Биологическая роль и диагностическое значение иммуноглобулинов; гипергаммаглобулинемия.

12. Белки острой фазы воспаления, классификация, характеристика.

 

Тестовые задания для самоконтроля

 

1

Концентрация белка в плазме крови составляет

1. 110-120 г/л

2. 65-85 г/л

3. 18-22 г/л

4. 35-45 г/л

2

Клетки следующего органа синтезируют большинство белков плазмы крови

1. Почек

2. Селезенки

3. Сердца

4. Печени

3

Белки плазмы крови осуществляют следующие функции

1. Участвуют в свёртывании крови

2. Передают информацию

3. Являются частью буферной системы крови

4. Осуществляют выведение токсичных веществ

4

Альбумин выполняет следующие основные функции

1. Связывает и транспортирует железо

2. Осуществляет коллоидно-осмотическую регуляцию

3. Служит богатым и быстрореализуемым резервом белка

4. Осуществляет транспорт тироксина

5

Вклад альбумина в формировании онкотического давления плазмы составляет

1. 15-20%

2. 75-80%

3. 30-40%

4. 100%

6

Белки плазмы крови создают давление

1. Гемодинамическое

2. Гидростатическое

3. Онкотическое

4. Осмотическое

7

Альбумин связывает в крови жирные кислоты, которые

1. Освобождаются при гидролизе триглицеридов в ЛПОНП

2. Синтезируются в печени

3. Освобождаются при липолизе в адипоцитах

4. Поступают из кишечника

8

Расположите фракции белков в том порядке, в каком они располагаются на фореграмме после электрофореза, начиная со старта (катода)

1. a2-Глобулины

2. g-Глобулины

3. a1-Глобулины

4. b-Глобулины

5. Альбумин

9

Содержание альбуминов в плазме крови составляет

1. 20-30 г/л

2. 2-4 г/л

3. 60-70 г/л

4. 35-50 г/л

10

Содержание глобулинов в плазме крови составляет

1. 40-50 г/л

2. 20-30 г/л

3. 18-26 г/л

4. 5-8 г/л

11

Сывороточный альбумин

1. Участвует в поддержании осмотического давления крови

2. Участвует в иммунных реакциях

3. Транспортирует многие ксенобиотики, в том числе и ряд лекарств

4. Связывает и транспортирует белково-пептидные гормоны

12

Установите соответствие между фракцией белков и ее концентрацией в плазме крови

1. a1-Глобулины

2. g-Глобулины

3. Альбумин

4. a2-Глобулины

5. b-глобулины

A. 52-58%

B. 6-10%

C. 2,5-4,4%

D. 10-21%

E. 8,5-14,5%

13

Для a2-макроглобулина характерно следующее

1. Является транспортером меди

2. Осуществляет транспорт билирубина

3. Является основным ингибитором протеаз плазмы

4. Нейтрализует бактерии

14

Церулоплазмин обладает следующей активностью

1. Ферроксидазной

2. Гидролазной

3. Супероксиддисмутазной

4. Дегидрогеназной

15

Установите соответствие между белками плазмы крови и выполняемыми ими функциями

1. Альбумин

2. Трансферрин

3. Гаптоглобин

А. Связывает гемоглобин

Б. Транспортирует ионы железа

В. Переносит билирубин

 

Лабораторная работа №2

 

Определение содержания общего белка в сыворотке (плазме)

крови биуретовым методом

 

Принцип метода. Метод основан на способности белков, содержащих пептидные связи, образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в пробе.

Исследуемый материал. Сыворотка или плазма крови без выраженного гемолиза и липемии.

Состав набора.

1. Реагент № 1. Биуретовый реактив, концентрат: натрия гидроокись – 0,5 М, калий-натрий виннокислый – 80 мМ, калий йодистый – 75 мМ, медь сернокислая – 30 мМ (200 мл).

2. Калибратор – раствор сывороточного альбумина – 70 г/л, натрия хлорид – 154 мМ (2 мл).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Реагент № 1. Реагент стабилен при комнатной температуре в течение 12 месяцев при хранении в темноте. Перед проведением анализа необходимое количество реагента № 1 разведите бидистиллированной водой в соотношении 1:4 (рабочий реагент).

Калибратор готов к использованию, стабилен в течение года при комнатной температуре. После вскрытия флакона стабилен не менее 6 месяцев. Тщательно закрывайте флаконы сразу после каждого использования реагентов.

 

Ход анализа

 

Подготовьте пробы согласно схеме (табл. 1):

Таблица 1

 

Подготовка пробы следующего состава

Опытная

проба

Калибровочная проба

Контрольная проба

Рабочий реагент, мл

5

5

5

Сыворотка (плазма) крови, мл

0,1

–

–

Калибратор, мл

–

0,1

–

Вода дистиллированная, мл

–

–

0,1

 

Пробы тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре 30 мин или 15 мин при 37°С. Фотометрируйте опытную и калибровочную пробы против контрольной пробы при длине волны 540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Окраска стабильна в течение часа.

Расчет концентрации (С) общего белка в исследуемом материале проведите по формуле:

 

,

 

где С – концентрация белка в г/л; Е пробы – оптическая плотность опытной пробы, Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы, 70 г/л – концентрация белка в калибраторе.

Нормальные значения: 65-85 г/л.

 

ЗАДАНИЕ

 

1. Определите содержание белка в сыворотке и плазме крови.

2. Сделайте вывод.

 

 

 

 

 

 

 

Лабораторная работа №3

 

Количественное определение альбумина в сыворотке крови методом,

основанным на биуретовой реакции

 

Принцип метода. При добавлении к пробам сыворотки крови этанольного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) определенной концентрации альбумин, в отличие от других белков, не подвергается осаждению, оставаясь в подкисленном спиртовом растворе, что позволяет установить его содержание методом, основанным на биуретовой реакции.

Исследуемый материал. Сыворотка или плазма крови.

Реактивы и их приготовление. 1. Раствор хлористого натрия (изотонический). 0,9 г NaCl растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

2. 0,2 н. раствор едкого натра, освобожденный от углекислого газа. 20 мл 1 н. раствора NaОН доводят до объема 100 мл прокипяченной дистиллированной водой.

3. Биуретовый реактив. 4,5 г сегнетовой соли (КNаС4Н4О6) растворяют в 40 мл 0,2 н. NaОН. После растворения прибавляют 1,5 г СuSO4·5Н2О и 0,5 г КI. Раствор доводят до 100 мл 0,2 н. NaОН. Хранят в темном месте (или в посуде из темного стекла). Реактив пригоден около месяца.

4. Щелочной раствор йодистого калия. 0,5 г КI растворяют в 100 мл 0,2 н. NaОН. Хранят в посуде из темного стекла не более двух недель.

5. Рабочий раствор биуретового реактива. 20 мл биуретового реактива (3) смешивают с 80 мл раствора Кl (4). Хранят в темном месте не более двух недель.

6. Стандартный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки). 1,0 г альбумина растворяют в мерной пробирке в 6-7 мл изотонического раствора NaCl с последующим доведением им до конечного объема 10 мл. Для полного растворения белка содержимое пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Поскольку пенообразование ускоряет разрушение альбумина, с целью предотвращения этого нежелательного эффекта можно внести одну (или несколько) капель октилового спирта либо медицинского (диэтилового) эфира, понижающих поверхностное натяжение.

1 мл стандартного раствора содержит 0,1 г белка (100 г/л). Можно использовать ампулированный раствор альбумина с концентрацией 100 (или 98) г/л.

7. Дополнительно используют реактив для выделения альбумина. Для его получения 3 г ТХУ растворяют в 100 мл 96% этанола. Реактив стоек.

 

Ход анализа

 

В центрифужную пробирку внесите 0,75 мл реактива для выделения альбумина и 0,25 мл исследуемой сыворотки крови. После перемешивания содержимого пробирки спустя 10 мин выдерживания пробы при комнатной температуре центрифугируйте ее в течение 10 мин при 1500 об/мин (на клинической центрифуге типа ОПН-3). 0,2 мл центрифугата (должен быть совершенно прозрачным) перенесите в другую химическую пробирку, в которую прилейте 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.

Параллельно определите содержание общего белка в сыворотке крови, для чего к 0,1 мл ее добавьте 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.

Пробы оставьте для окрашивания на 30 мин и фотометрируйте при 546 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Показатели абсорбции учитывают в сравнении с таковыми контрольной пробы (т.е. рабочего раствора биуретового реактива).

Расчет ведут по калибровочному графику. Для его построения из основного раствора белка (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка) готовят рабочие стандартные растворы, как указано в табл. 2. Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5,0 мл рабочего биуретового реактива. Через 30 мин замеряют оптическую плотность стандартных проб, учитывая абсорбцию контрольной пробы.

Таблица. 2

Данные к построению калибровочного графика для определения содержания альбумина сыворотки крови.

 

№

Стандартный раствор белка, мл

Изотонический

раствор NaCl, мл

Концентрация

альбумина, г/л

1

0,2

0,8

20

2

0,3

0,7

30

3

0,4

0,6

40

4

0,5

0,5

50

5

0,6

0,4

60

6

0,7

0,3

70

 

На основании построенной калибровочной кривой найдите фактор пересчета F (вычисляют фактор пересчета F делением концентрации белка на абсорбцию F = Сcm/Ecm).

Расчет концентрации. Для определения содержания альбумина в сыворотке крови значение оптической плотности (Е) умножьте на F и на 2 (коэффициент пересчета 0,05 мл сыворотки, приходящейся на 0,2 мл взятого для исследования центрифугата, на 0,1 мл используемой для определения содержания общего белка сыворотки крови):

 

С (г/л) = Еоп×F×2

 

где С – концентрация белка в г/л; Еоп – оптическая плотность опытной пробы, F – фактор пересчета.

Нормальные показатели. Содержание альбумина в сыворотке крови, определенное описанным способом, у практически здоровых взрослых людей составляет 40-50 г/л.

 

ЗАДАНИЕ

 

1. Определите содержание общего белка в плазме крови крыс биуретовым методом.

2. Определите концентрацию альбумина в плазме крови крыс предложенным методом.

3. Рассчитайте концентрацию альбумина в г/л и % от общего белка плазмы.

4. Сделайте вывод.

 

 

 

 

 

Лабораторная работа №4

 

Количественное определение альбумина в сыворотке крови колориметрическим

методом на основе реакции с бромкрезоловым зеленым

 

Принцип метода. При взаимодействии альбумина в слабокислой среде с бромкрезоловым зеленым (рис. 2) образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 628 нм.

 

 

Рис. 2. Структурная формула бромкрезолового зеленого.

 

Использование липемичных и гемолизированных образцов недопустимо.

Состав реагентов.

1. Монореагент, рН 4,2: Цитрат натрия – 100 ммоль/л, бромкрезоловый зеленый – 100 мкмоль/л.

2. Калибратор – раствор альбумина с концентрацией 60 г/л.

Реактивы готовы к использованию.

Сбор и подготовка проб. В качестве проб можно использовать сыворотку или плазму с ЭДТА. Не используйте гепарин в качестве антикоагулянта. Не рекомендуется использовать цельную кровь и гемолизат. Лучше всего использовать свежую сыворотку. Если пробы содержат осадок, отцентрифугируйте их перед началом анализа.

 

Ход определения

 

Подготовьте пробы согласно схеме (табл. 3).

Таблица 3

 

Состав пробы

Опытная проба

Калибровочная проба

Контрольная проба

Монореагент, мл

4,0

4,0

4,0

Сыворотка, мл

0,02

–

–

Калибратор, мл

–

0,02

–

Вода, мл

–

–

0,02

 

Пробы тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 5 мин при температуре 18-25°С. По окончании инкубации измерьте оптическую плотность пробы (E пробы) и калибратора (Е калибратора) против контроля на реактивы при длине волны 628 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Окраска стабильна в течение 3 часов после окончания инкубации при хранении проб в защищённом от света месте при комнатной температуре.

Расчет. Концентрацию альбумина в сыворотке или плазме (С, г/л) рассчитайте по формуле:

 

 

где Е пробы – оптическая плотность опытной пробы в единицах оптической плотности; Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы; 60 – концентрация альбумина в калибраторе, г/л.

Если концентрация альбумина превышает 60 г/л, разведите образец в 2 раза физиологическим раствором, повторите исследование и результат умножьте на 2.

Нормальные значения: содержание альбумина в сыворотке или плазме крови человека составляет 35-50 г/л.

 

ЗАДАНИЕ

1. Определите содержание альбумина в сыворотке и плазме крови.

2. Сделайте вывод.