Лабораторная работа №9

Количественное определение активности

аланинаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови

оптимизированным кинетическим энзиматическим методом

Принцип метода. Под действием фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аланина на α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции пируват при участии фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и кофермента НАДН превращается в лактат. Скорость окисления НАДН в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности АЛТ.

Схема реакции:

Исследуемый материал. Свежая негемолизированная сыворотка или плазма крови. Активность АЛТ в сыворотке или плазме крови снижается после 3-х дней хранения: при +2-8 °С на 10%, при +18-25°С на 17%.

Состав набора. Реагент 1. Буфер, рН 7,5, включающий трис, 100 ммоль/л; L-аланин, 500 ммоль/л; α-кетоглутарат, 15 ммоль/л; натрия азид, 0,03% – 1 флакон (50 мл) или 2 флакона (по 50 мл)

Реагент 2. Лиофилизированная смесь (конечная концентрация в рабочем реагенте: ЛДГ, 1300 ед/л; НАДH, 0,18 ммоль/л; натрия азид, 0,03%; бычий сывороточный альбумин, 1 г/л) – 1 или 2 флакона.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Перед проведением анализа смешайте необходимые количества Реагента 1 и Реагента 2 в соотношении 4:1. Рабочий реагент стабилен при +2-8°С в защищенном от света месте в плотно закрытом флаконе в течение 48 часов.

Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!

Ход анализа

Исследование проводите непосредственно в термостатируемой при +37°С фотометрической кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 340 нм против воздуха или воды.

Запуск реакции образцом: Смешайте 3 мл предварительно прогретого рабочего реагента и 0,3 мл анализируемого материала (соотношение 10:1). Через 1 мин начните считывание величины экстинкции с интервалом в 1 мин в течение 3-х мин. Вычислите среднее изменение экстинкции за 1 мин (ΔЕ/мин).

Расчет концентрации. Активность фермента (А, Ед/л) рассчитайте по формуле:

А=1746ΔЕ_340нм/мин,

где А – активность АЛТ в Ед/л; ΔЕ_340нм – среднее значение изменения экстинкции за минуту; 1746 – фактор пересчета в Ед/л.

Если ΔЕ/мин при запуске реакции образцом превышает 0,110 единиц оптической плотности, разведите исследуемый образец физиологическим раствором в 10 раз и повторите анализ; результат умножьте на фактор разведения 10.

Нормальные величины активности АЛТ в сыворотке или плазме крови у мужчин – от 10 до 40 Ед/л, у женщин – от 10 до 31 Ед/л.

ЗАДАНИЕ

1. Определите активность АЛТ в сыворотке или плазме крови человека и крысы.

2. Сделайте вывод.