Лабораторная работа №8

Количественное определение активности

аспартатаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови

энзиматическим кинетическим методом

Принцип метода. Под действием фермента аспартатаминотрансферазы (АСТ) в результате переаминирования происходит перенос аминогруппы с аспартата на α-кетоглутарат. Образующийся в данной реакции оксалоацетат при участии фермента малатдегидрогеназы (МДГ) и кофермента НАДН превращается в малат.

Схема реакции:

Скорость окисления НАДН в ходе второй реакции определяется по уменьшению оптической плотности реакционной среды при 340 нм и пропорциональна активности аспартатаминотрансферазы.

Исследуемый материал. Свежая негемолизированная сыворотка или плазма крови. Активность АСТ в сыворотке или плазме крови снижается после 3-х дней хранения: при +2-8°С на 10%, при +18-25°С на 17%.

Состав набора.

Реагент 1 (буфер-субстратный раствор).

Реагент 2 (фермент-кофакторная смесь (лиофилизат)).

Реагент 3 (стартовый реагент).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Перед проведением анализа содержимое одного флакона с Реагентом 2 растворите в содержимом одного флакона с Реагентом 1 при аккуратном перемешивании. Рабочий реагент готов к применению через 20 мин после растворения. Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!

Ход анализа

Исследование проводите непосредственно в термостатируемой при +37°С фотометрической кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 340 нм против воздуха или воды. Смешайте 3 мл рабочего реагента и 0,3 мл анализируемого материала. Через 1 минуту добавьте 0,3 мл стартового реагента, тщательно перемешайте и через 1 мин считывайте величины экстинкции с интервалом в 1 мин в течение 3-х мин. Вычислите среднее изменение экстинкции за 1 мин (ΔЕ/мин).

Расчет концентрации. Активность фермента АСТ (А, Ед/л) рассчитайте по формуле:

А=1905ΔЕ_340нм/мин

где: 1905 – фактор пересчета, в Ед/л; ΔЕ_340нм/мин – среднее значение изменения экстинкции за минуту. Если ΔЕ/мин при запуске реакции образцом превышает 0,100 оптических единиц, разведите исследуемый образец физиологическим раствором в 10 раз и повторите анализ; результат умножьте на фактор разведения 10.

Нормальные величины активности АСТ в сыворотке или плазме крови у мужчин – от 10 до 37 Ед/л, у женщин – от 10 до 31 Ед/л.

ЗАДАНИЕ

1. Определите активность АСТ в сыворотке или плазме крови человека и крысы.

2. Сделайте вывод.