Лабораторная работа №7

 

Определение содержания общего холестерина в сыворотке (плазме) крови

 

Принцип метода. Холестерин из состава эфиров высвобождается под действием фермента холестеролэстеразы (ХЭ). При участии фермента холестеролоксидазы (ХО) холестерин окисляется до 4-холестен-3-она. Образующаяся перекись водорода при участии фермента пероксидазы (ПО) способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина (4-ААП) и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию холестерина в исследуемом материале и определяется фотометрически при длине волны 500 (490-520) нм.

Схема реакции:

 

 

 

 

 

 

 


Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Исследуемый материал. Сыворотка, гепаринизированная или ЭДТА-плазма крови без следов гемолиза. Проба стабильна 7 дней при 2-8°С.

Состав набора. Монореагент: 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,5, фенол – 20 мМ, холестеролэстераза – 400 Ед/л, холестеролоксидаза – 250 Ед/л, пероксидаза – 500 Ед/л, 4-аминоантипирин – 0,4 мМ, детергенты, стабилизаторы (250 мл).

Калибратор – раствор холестерина с концентрацией 5,17 ммоль/л (200 мг/100 мл) (1,5 мл).

 

Ход анализа

 

Готовьте инкубационные пробы согласно табл. 7.

Таблица 7

 

Состав проб

Опытная проба

Калибровочная проба

Контрольная проба

Монореагент, мл

2,0

2,0

2,0

Сыворотка (плазма), мл

0,02

–

–

Калибратор, мл

–

0,02

–

Вода дистиллированная, мл

–

–

0,02

 

Пробы перемешайте и инкубируйте не менее 15 мин при температуре 18-25°С или 10 минут при 37°С. Измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 500 нм (490-520 нм). Окраска стабильна не менее 2 часов после окончания инкубации при предохранении от прямого света.

Расчет концентрации (С) холестерина в исследуемом образце проведите по формуле:

 

 

 

где С – концентрация холестерина в пробе в моль/л (мг/100 мл); Е пробы – оптическая плотность опытной пробы, Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы, 200 мг/100 мл или 5,17 ммоль/л – концентрация холестерина в калибраторе.

Нормальные показатели до 200 мг/100 мл (5,17 ммоль/л);

Пограничные показатели от 200 до 250 мг/100 мл (5,17-6,50 ммоль/л);

Патологические показатели свыше 250 мг/100 мл (6,50 ммоль/л).

 

ЗАДАНИЕ

 

1. Определите содержание холестерина в сыворотке (плазме) крови человека и крысы.

2. Сделайте вывод.