Лабораторная работа №6

 

Количественное определение содержания триглицеридов в крови

 

Принцип метода. Определение концентрации триглицеридов основано на проведении ряда сопряжённых ферментативных реакций, катализируемых липазой, глицерокиназой (ГК) в присутствии АТФ, глицеролфосфатоксидазой (ГФО) и пероксидазой (ПО).

Образующаяся в ходе данных реакций перекись водорода (Н2О2) способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина (4-ААП) и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель).

Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию триглицеридов в исследуемом материале и измеряется фотометрически при длине волны 500 (490-520) нм.

Схема реакции:

 

 

 

 

 

 

 

 


Исследуемый материал. Свежая негемолизированная сыворотка, ЭДТА- или гепаринизированная плазма крови. Билирубин в концентрации до 300 мкмоль/л и гемоглобин в концентрации до 6,0 г/л не влияют на правильность определения триглицеридов.

Состав набора. Реагент 1. Реагент 2. Калибратор (калибровочный раствор триглицеридов с концентрацией 2,29 ммоль/л в пересчете на триолеин).

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Приготовление рабочего реагента: содержимое одного флакона с Реагентом 2 растворите в содержимом одного флакона с Реагентом 1 при аккуратном перемешивании. Рабочий реагент готов к применению через 20 минут после полного растворения лиофилизата. Рабочий реагент храните при +2-8°С в защищённом от света месте в плотно закрытом флаконе не более 20 дней.

Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!

 

Ход анализа

 

Внесите в пробирки рабочий реагент, анализируемые образцы, калибратор и дистиллированную воду в объёмах, указанных в табл. 6.

Таблица 6

 

Состав проб

Опытная проба

Калибровочная проба

Контрольная проба

Рабочий реагент, мл

2,00

2,00

2,00

Исследуемый образец, мл

0,02

–

–

Калибратор, мл

–

0,02

–

Вода дистиллированная, мл

–

–

0,02

 

Реакционную смесь тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре (+18-25°С) или в течение 10 минут при +37°С. Измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы при длине волны 500 (490-520) нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см.

Окраска растворов стабильна в течение 2 часов после окончания инкубации при хранении проб в защищённом от света месте при комнатной температуре (+18-25°С).

Расчет концентрации триглицеридов в исследуемом образце произведите по следующей формуле:

 

,

 

где С – концентрация триглицеридов в моль/л, Е пробы – оптическая плотность опытной пробы, Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы, 2,29 – концентрация триглицеридов в калибраторе, ммоль/л.

Нормальные показатели. Концентрация триглицеридов в сыворотке или плазме крови в норме составляет 0,34-1,71 ммоль/л.

 

ЗАДАНИЕ

 

1. Определите содержание триглицеридов в сыворотке (плазме) крови крыс.

2. Сделайте вывод.