Лабораторная работа №3

 

Количественное определение альбумина в сыворотке крови методом,

основанным на биуретовой реакции

 

Принцип метода. При добавлении к пробам сыворотки крови этанольного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) определенной концентрации альбумин, в отличие от других белков, не подвергается осаждению, оставаясь в подкисленном спиртовом растворе, что позволяет установить его содержание методом, основанным на биуретовой реакции.

Исследуемый материал. Сыворотка или плазма крови.

Реактивы и их приготовление. 1. Раствор хлористого натрия (изотонический). 0,9 г NaCl растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

2. 0,2 н. раствор едкого натра, освобожденный от углекислого газа. 20 мл 1 н. раствора NaОН доводят до объема 100 мл прокипяченной дистиллированной водой.

3. Биуретовый реактив. 4,5 г сегнетовой соли (КNаС4Н4О6) растворяют в 40 мл 0,2 н. NaОН. После растворения прибавляют 1,5 г СuSO4·5Н2О и 0,5 г КI. Раствор доводят до 100 мл 0,2 н. NaОН. Хранят в темном месте (или в посуде из темного стекла). Реактив пригоден около месяца.

4. Щелочной раствор йодистого калия. 0,5 г КI растворяют в 100 мл 0,2 н. NaОН. Хранят в посуде из темного стекла не более двух недель.

5. Рабочий раствор биуретового реактива. 20 мл биуретового реактива (3) смешивают с 80 мл раствора Кl (4). Хранят в темном месте не более двух недель.

6. Стандартный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки). 1,0 г альбумина растворяют в мерной пробирке в 6-7 мл изотонического раствора NaCl с последующим доведением им до конечного объема 10 мл. Для полного растворения белка содержимое пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Поскольку пенообразование ускоряет разрушение альбумина, с целью предотвращения этого нежелательного эффекта можно внести одну (или несколько) капель октилового спирта либо медицинского (диэтилового) эфира, понижающих поверхностное натяжение.

1 мл стандартного раствора содержит 0,1 г белка (100 г/л). Можно использовать ампулированный раствор альбумина с концентрацией 100 (или 98) г/л.

7. Дополнительно используют реактив для выделения альбумина. Для его получения 3 г ТХУ растворяют в 100 мл 96% этанола. Реактив стоек.

 

Ход анализа

 

В центрифужную пробирку внесите 0,75 мл реактива для выделения альбумина и 0,25 мл исследуемой сыворотки крови. После перемешивания содержимого пробирки спустя 10 мин выдерживания пробы при комнатной температуре центрифугируйте ее в течение 10 мин при 1500 об/мин (на клинической центрифуге типа ОПН-3). 0,2 мл центрифугата (должен быть совершенно прозрачным) перенесите в другую химическую пробирку, в которую прилейте 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.

Параллельно определите содержание общего белка в сыворотке крови, для чего к 0,1 мл ее добавьте 5,0 мл рабочего раствора биуретового реактива.

Пробы оставьте для окрашивания на 30 мин и фотометрируйте при 546 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Показатели абсорбции учитывают в сравнении с таковыми контрольной пробы (т.е. рабочего раствора биуретового реактива).

Расчет ведут по калибровочному графику. Для его построения из основного раствора белка (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка) готовят рабочие стандартные растворы, как указано в табл. 2. Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5,0 мл рабочего биуретового реактива. Через 30 мин замеряют оптическую плотность стандартных проб, учитывая абсорбцию контрольной пробы.

Таблица 2

Данные к построению калибровочного графика для определения содержания альбумина сыворотки крови.

 

№

Стандартный раствор белка, мл

Изотонический

раствор NaCl, мл

Концентрация

альбумина, г/л

1

0,2

0,8

20

2

0,3

0,7

30

3

0,4

0,6

40

4

0,5

0,5

50

5

0,6

0,4

60

6

0,7

0,3

70

 

На основании построенной калибровочной кривой найдите фактор пересчета F (вычисляют фактор пересчета F делением концентрации белка на абсорбцию F = Сcm/Ecm).

Расчет концентрации. Для определения содержания альбумина в сыворотке крови значение оптической плотности (Е) умножьте на F и на 2 (коэффициент пересчета 0,05 мл сыворотки, приходящейся на 0,2 мл взятого для исследования центрифугата, на 0,1 мл используемой для определения содержания общего белка сыворотки крови):

 

С (г/л) = Еоп×F×2

 

где С – концентрация белка в г/л; Еоп – оптическая плотность опытной пробы, F – фактор пересчета.

Нормальные показатели. Содержание альбумина в сыворотке крови, определенное описанным способом, у практически здоровых взрослых людей составляет 40-50 г/л.

 

ЗАДАНИЕ

 

1. Определите содержание общего белка в плазме крови крыс биуретовым методом.

2. Определите концентрацию альбумина в плазме крови крыс предложенным методом.

3. Рассчитайте концентрацию альбумина в г/л и % от общего белка плазмы.

4. Сделайте вывод.