Лабораторная работа №22

Изучение оптических свойств различных форм гемоглобина

Каждая форма гемоглобина характеризуется определенным спектром поглощения, представляющим собой зависимость оптической плотности раствора гемоглобина от длины волны света. Наиболее интенсивной полосой в спектре поглощения гемоглобина является полоса Соре, принадлежащая порфириновой части его молекулы (рис. 5).

Рис. 5. Спектр поглощения производных гемоглобина. Спектры поглощения дезоксигемоглобина (1), оксигемоглобина (2) и ферригемоглобина (3)

По изменению положения и интенсивности поглощения этой полосы можно судить о структурных изменениях молекул различных форм гемоглобина (табл. 22).

Таблица 22

Спектральные характеристики различных форм гемоглобина

Формы гемоглобина	α-Полоса		β-Полоса		Полоса Соре
	λ, нм	ελ, М^-1см^-1	λ, нм	ελ, М^-1см^-1	λ, нм	ελ, М^-1см^-1
Оксигемоглобин	557	14600	542	13800	412	135000
Дезоксигемоглобин	555	13500			430	119000
Карбоксигемоголобин	569	13400	539	13400	419	191000

Оборудование и материалы. СФ-(46) или другой спектрофотометр, центрифуга на 9000 об/мин, центрифужные пробирки, кюветы, пенициллиновые флаконы, пипетки Пастера, прибор для получения оксида углерода, гемоглобин кристаллический, хлористый натрий, гепарин, бихромат калия, феррицианид калия, дитионит натрия.

Получение раствора оксигемоглобина. Для работы рекомендуется использовать свежеприготовленные растворы гемоглобина. Кровь берут у декапитированных животных. Цельную кровь стабилизируют гепарином, растворенным в 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Для отделения плазмы стабилизированную кровь центрифугируйте в течение 10 мин при 3000 об/мин. Плазму крови отберите пипеткой. К эритроцитам добавьте трехкратный объем 0,85%-ного раствора хлористого натрия, осторожно при этом размешивая суспензию стеклянной палочкой. Суспензию центрифугируйте в течение 5 мин при 6000 об/мин. Промойте эритроциты 3 раза. Промытые эритроциты подвергните гемолизу дистиллированной водой в течение 20 мин. Стромы осадите центрифугированием при 9000 об/мин в течение 15 мин. В прозрачном гемолизате определите содержание гемоглобина с помощью приведенного в работе № 20 метода.

Ход анализа

Регистрация спектра поглощения оксигемоглобина. Раствор оксигемоглобина разбавьте дистиллированной водой до оптической плотности раствора, попадающей в диапазон 0,4-0,5. Снимите спектр поглощения раствора оксигемоглобина в интервале длин волн 380-600 нм (оптическая плотность раствора измеряется через каждые 5 нм).

Регистрация спектра поглощения метгемоглобина. Добавьте к раствору оксигемоглобина 1-2 капли насыщенного раствора феррицианида калия. Визуально оцените изменение окраски. Раствор метгемоглобина имеет коричневую окраску. Снимите спектр поглощения раствора гемоглобина в интервале длин волн 380-600 нм. Для компенсации светопоглощения за счет феррицианида в контроль добавьте такой же объем раствора этого вещества, какой был добавлен к раствору оксигемоглобина.

Регистрация спектра поглощения метгемоглобина. Добавьте к водному раствору оксигемоглобина несколько кристаллов дитионита натрия (Na₂S₂O₄). Визуально оцените изменение окраски. Ярко алая окраска (цвет оксигемоглобина) переходит в синевато-красную, характерную для гемоглобина. Снимите спектр поглощения раствора в интервале длин волн 380-600 нм.

ЗАДАНИЕ

1. Представьте в графическом виде зависимость оптической плотности различных состояний гемоглобина от длины поглощаемого света (спектр поглощения), откладывая по оси ординат оптическую плотность раствора, а по оси абсцисс соответствующие длины волн.

2. Найдите минимумы и максимумы поглощения гемоглобинов и сделайте вывод.