Лабораторная работа №21

Количественное определение концентрации общего

и прямого билирубина в сыворотке крови

Принцип метода. Прямой билирубин непосредственно реагирует с диазотированной сульфаниловой кислотой, а общий билирубин – в присутствии кофеинового реагента, образуя окрашенное азосоединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию билирубина; измеряется фотометрически при длине волны 535 (500-560) нм.

Исследуемый материал. Свежая негемолизированная сыворотка крови.

Состав набора.

1. Кофеиновый реагент.

2. Сульфаниловая кислота.

3. Натрия нитрит.

4. Физиологический раствор.

5. Калибратор (лиофилизат), концентрация билирубина после растворения содержимого в 1 мл деионизованной воды – 171 мкмоль/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность.

Приготовление рабочего реагента. Смешайте необходимые количества сульфаниловой кислоты и натрия нитрита в соотношении 40:1. Полученный рабочий реагент (диазореагент) стабилен в течение 10 дней при +2-8°С в плотно закрытой посуде из темного стекла или не менее 48 часов при +18-25°С.

Приготовление калибратора. Содержимое флакона с лиофилизатом калибратора растворите в 1,0 мл деионизованной воды. Концентрация билирубина в полученном растворе калибратора составляет 171 мкмоль/л. Приготовленный калибратор стабилен в защищенном от света месте при +2-8°С не более 5 дней.

Ход анализа

Приготовьте пробы в соответствии с табл. 21:

Таблица 21

Состав проб	Опытные пробы		Контрольная проба	Калибровочная проба
	общий билирубин	прямой билирубин
Сыворотка крови, мл	0,4	0,4	0,4	–
Калибратор, мл	–	–	–	0,4
Физ. раствор, мл	0,4	3,2	3,6	0,4
Кофеиновый реагент, мл	2,8	–	–	2,8
Рабочий реагент, мл	0,4	0,4	–	0,4

Пробы тщательно перемешайте. Для определения прямого билирубина пробу фотометрируйте не позднее 5 мин после добавления рабочего реагента. Для определения общего билирубина пробу инкубируйте при +18-25°С в течение 20 мин. Оптическую плотность опытных проб измерьте против контрольной (холостой) пробы при длине волны 535 (500-560) нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Оптическую плотность калибратора измерьте в тех же условиях против дистиллированной воды.

Расчет концентрации (С, мкмоль/л) билирубина в исследуемом образце проведите по формуле:

,

где С – концентрация билирубина в мкмоль/л; Е пробы – оптическая плотность опытной пробы; Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы; 171 мкмоль/л – концентрация билирубина в калибраторе.

Нормальные показатели: прямого билирубина – до 4 мкмоль/л; общего билирубина – 8,5-20,5 мкмоль/л.

ЗАДАНИЕ

1. Определите содержание билирубина в сыворотке крови человека и крысы.

2. Сделайте вывод.