Лабораторная работа №19

Определение активности каталазы в крови

Принцип метода. Об активности фермента судят по скорости убыли перекиси водорода в среде инкубации. Концентрацию перекиси водорода определяют по реакции с молибдатом аммония, который дает стойкий окрашенный комплекс.

Исследуемый материал (образец). Кровь собирают в стеклянные пробирки с гепарином (200 Ед/мл) и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Плазму отбирают, а эритроциты трижды отмывают холодным физ.раствором, каждый раз центрифугируя при тех же оборотах в течение 5 мин. Отмытые эритроциты гемолизируют, для чего к 0,3 мл упакованных эритроцитов с помощью пипетки сильной струей приливают 2,7 мл охлажденной бидистиллированной воды. Гемолизат периодически встряхивают в течение 5 мин, а затем центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин для осаждения стромы и неразрушенных клеток. Прозрачный гемолизат сливают в стоящую на льду пробирку и используют как для определения активности каталазы, так и для определения концентрации гемоглобина.

Реактивы.

1. 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

2. 4%-ный раствор молибдата аммония.

3. 10%-ный раствор серной кислоты.

4. 0,034%-ный раствор перекиси водорода.

Все реактивы готовят на бидистиллированной воде.

Ход анализа

Перед работой полученный 10%-ный гемолизат разбавьте в 25 раз (0,1 мл гемолизата + 2,4 мл воды) и используйте в качестве источника фермента.

Инкубационная среда включает 2 мл 0,034%-ной перекиси водорода и 0,04-0,05 мл 0,1%-ного гемолизата.

В пробирки разлейте по 2 мл перекиси водорода и предварительно инкубируйте в течение 5 мин при 25°С. Затем в каждую пробирку внесите по 0,05 мл гемолизата. В контрольную пробирку вместо ферментативного препарата внесите такое же количество воды. Пробы инкубируйте в течение 2 мин при 25°С. По истечении времени реакцию остановите добавлением 1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Оптическую плотность проб измерьте при длине волны 410 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм.

Расчет концентрации. Об активности каталазы судят по степени уменьшения оптической плотности в опытных пробах (Е_о) по сравнению с контрольной (Е_к):

Стандартная проба (Е_ст): 1,0 мл 0,1%-ного раствора перекиси водорода доведите до 5 мл дистиллированной водой. Затем в пробирку внесите 1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Пробы инкубируйте при 24°С 10 мин, а затем оптическую плотность измерьте при длине волны 410 нм против воды.

Активность фермента (А_кат, мкмоль Н₂О₂/мг Hb/ мин) рассчитайте по формуле:

,

где 34 – молекулярная масса перекиси водорода; t – время протекания реакции, мин; С – концентрация гемоглобина в пробе, мг; F – фактор пересчета значений оптической плотности в мг перекиси водорода (рассчитывают по калибровочному графику).

Построение калибровочной кривой. Предварительно приготовьте 0,1%-ный раствор перекиси водорода. Затем разбавьте его водой, как указано ниже (табл. 19).

Таблица 19.

Схема приготовления стандартных растворов перекиси водорода.

№ пробирки	0,1%-ный раствор перекиси водорода, мл	Дистиллированная вода, мл	Концентрация перекиси водорода в 5 мл раствора, мг
1	0,25	4,75	0,25
2	0,5	4,50	0,5
3	1,0	4,0	1,0
4	1,5	3,5	1,5
5	2,0	3,0	2,0
6	2,5	2,5	2,5

Из каждой пробирки (№ 1-6) отберите по 2 мл разбавленного раствора перекиси водорода и перенесите в сухие пробирки (№ 1-6). При этом содержание перекиси водорода в пробирках будет: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мг. Затем в каждую пробирку внесите 1 мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Пробы инкубируйте при 24°С 10 мин, а затем оптическую плотность измерьте при длине волны 410 нм против воды. По полученным данным постройте калибровочную кривую, которую используйте в дальнейшем для расчета активности каталазы.

Концентрацию гемоглобина в гемолизате определите как описано в работе №20.

ЗАДАНИЕ

1. Определите активность каталазы в гемолизатах.

2. Сделайте вывод.