Лабораторная работа №18

Метод количественного определения содержания

восстановленного глутатиона в эритроцитах

Общая характеристика. Глутатион (GSH) – это трипептид γ-глутамилцистеинилглицин (рис. 3).

Рис. 3. Строение глутатиона.

GSH содержит необычную пептидную связь между аминогруппой цистеина и карбокси-группой боковой цепи глутамата. Важность GSH в клетке определяется его антиоксидантными свойствами. GSH не только защищает клетку от таких токсичных агентов, как свободные радикалы, но и в целом определяет редокс-статус внутриклеточной среды.

Концентрация GSH в клетках составляет 1-10 мМ. Такая высокая концентрация GSH в клетке способствует восстановлению любой дисульфидной связи (S-S), образующейся между цистеинами цитозольных белков. При этом GSH превращается в окисленную форму GSSG. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента глутатионредуктазы, которая постоянно находится в клетке в активном состоянии и индуцируется при оксидативном стрессе. Отношение GSH/GSSG внутри клетки является одним из важнейших параметров, который показывает уровень оксидативного стресса.

Принцип метода: Восстановленный глутатион реагирует с 5,5ʹ-дитиобис (2-нитробензойной) кислотой (ДТНБК) (реагент Эллмана) (рис. 4) с образованием сложного соединения, которое обладает максимумом поглощения при 412 нм.

Рис. 4. Химическая структура реактива Эллмана.

Исследуемый материал (образец). Количество GSH определяют в эритроцитах.

Реактивы. 1. 30% трихлоруксусная кислота (ТХУ). Растворить 30 г ТХУ в дистиллированной воде и довести объем до 100 мл.

2. 0,3 М трис-HCl буфер рН 8,8 Растворить 36,33 г трис(гидроксиаминометан) в 0,99 л дистиллированной воды, рН довести путем добавления по каплям концентрированной НСl ( ≈ 7 мл 36% НСl). Объем довести до 1 л.

3. 10 мМ реактив Эллмана на метаноле. 3,96 мг реагента Эллмана растворить в метаноле и довести до 1 мл. Реактив стабилен 2 недели при хранении +4ºС в сосуде с плотно закрытой крышкой.

4. Стандартные растворы GSH для калибровки 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 ммоль/л.

Ход определения

К 1 мл эритроцитов добавьте 0,2 мл 30% ТХУ, перемешайте. Через 10 мин пробу центрифугируйте при 3000 об/мин в течение 10 мин. К 1 мл надосадочной жидкости добавьте 2,5 мл буфера и 0,05 мл реактива Эллмана. Холостая проба содержит 3,5 мл буфера и 0,05 мл реактива Эллмана. Пробы перемешайте и оставьте на 10 мин для развития окраски и фотометрируйте пробы при λ = 412 нм относительно дистиллированной воды (контроль) в кювете с длиной оптического пути 1 см.

Расчет концентрации. Расчет концентрации GSH производите по формуле:

С (ммоль/л) = Е_оп×F×1,2×1000

где С – концентрация GSH в ммоль на 1 л эритроцитов; Е_оп – оптическая плотность опытной пробы, F – фактор пересчета; 1,2 – объем пробы после добавления ТХУ; 1000 – объем эритроцитов, мл.

Фактор пересчета находят из калибровочной кривой, для построения которой используйте растворы восстановленного глутатиона с концентрациями от 0,02 до 2,0 мМ. К 1 мл каждого стандартного раствора добавьте 2,5 мл буфера и 0,05 мл реактива Эллмана и через 10 мин замеряйте оптическую плотность стандартных проб, учитывая абсорбцию контрольной пробы, где вместо раствора глутатиона взят 1 мл буфера.

Нормальные показатели. Содержание GSH, определенное описанным способом, у практически здоровых взрослых людей составляет 2-3 ммоль/л.

ЗАДАНИЕ

1. Определите содержание GSH в эритроцитах человека и крысы.

2. Сделайте вывод.