Лабораторная работа №14

 

Определение содержания глюкозы в крови энзиматическим

колориметрическим методом

 

Принцип метода. β-D-глюкоза под действием фермента глюкозооксидазы (GOD) окисляется с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Образующаяся в данной реакции перекись водорода (Н2О2) при участии фермента пероксидазы (POD) способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина (4-ААP) и фенола с образованием окрашенного соединения (хинониминовый краситель). Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию глюкозы в исследуемом материале и определяется фотометрически при длине волны 500 (490-540) нм.

Схема реакции:

 

 

 

 

 


Исследуемый материал. Сыворотка или плазма крови. Отделить от клеточных элементов немедленно! Проба стабильна 24 часа при 18-25°С, 7 дней при 4°С при добавлении ингибиторов гликолиза (NaF, KF).

Состав набора.

1. Реагент № 1. Буфер: 0,15 М фосфатный буфер, рН 7,5; фенол – 10 ммоль/л.

2. Реагент № 2. Лиофилизат. Концентрация после разведения: глюкозооксидаза – 25 кЕд/л, пероксидаза – 1,5 кЕд/л; 4-аминоантипирин – 0,6 ммоль/л.

3. Калибратор – раствор глюкозы, 10 ммоль/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Приготовление рабочего реагента: Содержимое одного флакона с Реагентом 2 растворите в содержимом одного флакона с Реагентом 1 при аккуратном перемешивании.

Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 20-30 мин. Рабочий реагент храните при +2-8°С в защищённом от света месте в плотно закрытом флаконе не более 6 месяцев. Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!

 

Ход анализа

 

Подготовьте пробы следующего состава (табл. 14):

Таблица 14

 

Состав проб

Опытная проба

Калибровочная проба

Контрольная проба

Рабочий реагент, мл

2,00

2,00

2,00

Исследуемая проба, мл

0,01

–

–

Калибратор, мл

–

0,01

–

Вода дистиллированная, мл

–

–

0,01

 

Пробы тщательно перемешайте, а затем инкубируйте в течение 10 мин при 37°С или 20 мин при комнатной температуре (20-25°С). После окончания инкубации измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 500 нм (490-540 нм) в 5 мм кюветах. Окраска стабильна не менее 1 часа после окончания инкубации при предохранении от прямого света.

Расчет концентрации (С) глюкозы в исследуемом образце произведите по формуле:

 

,

 

где С – концентрация глюкозы в моль/л; Е пробы – оптическая плотность исследуемой пробы, Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы, 10 ммоль/л – концентрация глюкозы в калибраторе.

Нормальные показатели для плазмы (сыворотки)– 4,2-6,1 ммоль/л.

 

ЗАДАНИЕ

 

1. Определите содержание глюкозы в сыворотке (плазме) крови крыс до и после кормления.

2. Сделайте вывод.