Лабораторная работа №13

Количественное определение содержания мочевой кислоты в крови

Принцип метода. Определение основано на проведении сопряженных реакций, катализируемых уриказой и пероксидазой. Мочевая кислота под действием фермента уриказы окисляется до аллантоина, перекиси водорода и двуокиси углерода. Образующаяся в данной реакции перекись водорода при участии фермента пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 3,5-дихлоргидрокси-2-бензенсульфоната (DCHBS) и 4-аминоантипирина (4-ААП) с образованием окрашенного соединения (хинонимин).

Схема реакции:

Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна содержанию мочевой кислоты в исследуемом материале и определяется фотометрически при длине волны 500 нм (490-540 нм).

Исследуемый материал. Негемолизированная сыворотка или плазма крови.

Состав набора.

1. Реагент 1. Буфер: фосфат – 150 ммоль/лМ, 3,5-дихлоргидрокси-2-бензенсульфоната (DCHBS) – 2,5 ммоль/л.

2. Реагент 2. Лиофилизат: уриказа – 30 Ед/л, аскорбатоксидаза – 250 Ед/л, пероксидаза – 250 Ед/л, 4-аминоантипирин – 0, 25 ммол/л.

3. Калибратор: калибровочный раствор мочевой кислоты с концентрацией 357 мкмоль/л, альбумин – 50 г/л.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность. Содержимое одного флакона с Реагентом 2 растворите в 50 мл Реагента 1 при аккуратном перемешивании. Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после растворения лиофилизата в течение 1 ч при комнатной температуре +18-25°С.

Рабочий реагент стабилен при +2-8°С в защищенном от света месте в плотно закрытом флаконе не менее 3-х недель. Тщательно закрывайте флаконы с реагентами после каждого использования!

Ход анализа

Компоненты реакционной среды внесите в пробирки в соответствии с табл. 13.

Таблица 13

Состав проб	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Рабочий реагент, мл	4,00	4,00	4,00
Исследуемый образец, мл	0,1	–	–
Калибратор, мл	–	0,1	–
Вода дистиллированная, мл	–	–	0,1

Объемы исследуемого образца и рабочего реагента можно изменить, соблюдая соотношение 1:40.

Содержимое пробирок тщательно перемешайте и инкубируйте 7 мин при 18-25°С или 5 мин при 37°С. Измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы при длине волны 500 (490-540) нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см. Окраска растворов стабильна в течение 40 мин после окончания инкубации.

Расчет концентрации (С, мкмоль/л) мочевой пробы в исследуемом образце производите по формуле:

,

где С – концентрация мочевой кислоты в мкмоль/л; Е пробы – оптическая плотность опытной пробы; Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы; 357 мкмоль/л – концентрация мочевой кислоты в калибраторе.

Нормальные показатели – у мужчин 202-416 мкмоль/л, у женщин 142-339 мкмоль/л.

ЗАДАНИЕ

1. Определите содержание мочевой кислоты в сыворотке (плазме) крови крыс.

2. Сделайте вывод.