Лабораторная работа №11

Определение содержания мочевины в плазме крови уреазным

фенол/гипохлоритным методом

Принцип метода. Мочевина под действием уреазы гидролизуется с образованием карбоната аммония. Ионы аммония реагируют в присутствии нитропруссида с фенолом и гипохлоритом, образуя окрашенный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Исследуемый материал. Свежая сыворотка (плазма) крови без следов гемолиза (недопустимо использовать в качестве антикоагулянта оксалат).

Состав набора.

1. Реагент №1 (раствор уреазы): уреаза – 10 Ед/мл, фосфатный буфер, рН 7,0 – 50 ммоль/л, стабилизаторы.

2. Реагент №2. Калибратор: мочевина – 5 ммоль/л (30 мг/100 мл).

3. Реагент №3 (фенол/нитропруссидный реагент): фенол – 106 ммоль/л, нитропруссид натрия – 0,17 ммоль/л.

4. Реагент №4 (гипохлорит): гипохлорит натрия – 11 ммоль/л, натрий едкий – 125 ммоль/л.

Приготовление рабочего реагента. Все реагенты готовы к использованию.

Ход анализа

Компоненты реакционной смеси внесите в пробирки вместимостью 10 мл в количествах, указанных в табл. 9.

Таблица 9

Состав пробы	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Плазма (сыворотка), мл	0,01	–	–
Реагент №1, мл	0,1	0,1	0,1
Реагент №2, Калибратор, мл	–	0,01	–
Вода дистиллированная, мл	–	–	0,01

Пробы тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 5-10 мин при температуре 20-25°С. Затем в каждую пробу добавьте Реагент №3 и №4 в последовательности, указанной в табл. 10.

Таблица 10

Добавляемые в пробу реагенты	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Реагент №3, мл	1	1	1
Реагент №4, мл	1	1	1

После перемешивания пробы инкубируйте в течение 15 мин при 37°С в термостате. После окончания инкубации пробы охладите под проточной водой, и измерьте оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы при длине волны 540 (490-600) нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 5 мм. Окраска стабильна 5-8 часов после окончания инкубации.

Расчет концентрации (С) мочевины в исследуемом образце проведите по формуле:

,

где С – концентрация мочевины в опытной пробе, ммоль/л; Е пробы – оптическая плотность опытной пробы, Е калибратора – оптическая плотность калибровочной пробы; 5 ммоль/л – концентрация мочевины в калибровочном растворе.

Нормальные показатели: 2,5-8,3 ммоль/л.

ЗАДАНИЕ

1. Определите содержание мочевины в сыворотке крови человека и крысы.

2. Сделайте вывод.