7.7. Определение способности плазмы крови к расщеплению перекиси водорода

(общей, ферментативной и неферментативной)

Принцип метода. Способность нативной плазмы крови к расщеплению Н₂О₂ оценивают по ее убыли в инкубационной смеси.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,05 М трис-НС1 буфер, рН 7,4.

2. 0,1 М раствор перекиси водорода. Концентрацию Н₂О₂ определяют по методике, описанной выше.

3. 0,02 М раствор азида натрия.

Ход определения. Для определения общей (неферментативной + ферментативной) и неферментативной способности плазмы к расщеплению Н₂О₂ готовят две контрольные и две опытные пробы. Каждую опытную пробу сравнивают с соответствующим контролем. Контрольная и опытная пробы № 1 содержат по 0,1 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,4) и по 0,02 мл нативной плазмы. Для получения конечного объема 2,5 мл добавляют необходимое количество бидистиллированной воды. Реакцию запускают добавлением только в опытную пробу 1,8 мл 0,1 М раствора Н₂О₂. После инкубации в течение 10 мин в термостате при температуре 37 °С сразу измеряют оптическую плотность контрольной и опытной проб при длине волны 230 нм. Сравнивая контрольную и опытную пробы, определяют количество оставшейся после разрушения перекиси водорода, используя коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода, равный 0,071, и по полученным результатам судят об общей способности плазмы крови к расщеплению перекиси водорода.

Инкубационная среда контрольной и опытной проб № 2 содержит, кроме 0,1 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (рН 7,4) и 0,02 мл исследуемой нативной плазмы, 0,4 мл 0,02 М раствора азида натрия в качестве ингибитора ферментов, способных расщеплять Н₂О₂ (каталазы, пероксидазы). Конечный объем – 2,5 мл – доводят бидистиллированной водой. Реакцию в опытной пробе запускают добавлением 1,8 мл раствора Н₂О₂. Пробы инкубируют при температуре 37 °С в течение 10 мин, а затем немедленно снимают показания на спектрофотометре при длине волны 230 нм. Полученные показания прибора соответствуют неферментативной способности плазмы к расщеплению Н₂О₂. Разница между результатами опытов 1 и 2 отражает ферментативную способность плазмы к расщеплению перекиси водорода. Параллельно проводят определение исходного количества Н₂О₂ в инкубационной среде при длине волны 230 нм без добавления биологического материала.

О ферментативной способности плазмы к расщеплению Н₂О₂ судят по убыли перекиси водорода за 1 мин, выражают в ммолях Н₂О₂ и относят к 1 мл плазмы или к 1 мг белка.

Литература

Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. – СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. – 104 с.