7.4. Определение активности глутатионпероксидазы

7.4.1. Определение активности глутатионпероксидазы в эритроцитах

с использованием гидроперекиси третичного бутила

Принцип метода. ГПО катализирует расщепление гидроперекиси третбутила, используя в качестве субстрата восстановленный глутатион. С помощью реагента Эллмана, т. е. ДТНБ, определяют концентрацию оставшегося после реакции глутатиона. Реактив Эллмана взаимодействует с SH-группами глутатиона, образуя окрашенное соединение – тионитрофенильный анион. Количество последнего прямо пропорционально количеству SH-групп, прореагировавших с реактивом Эллмана. Об активности ГПО судят по уровню израсходованного в результате реакции восстановленного глутатиона.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,05 М фосфатный буфер с 5 мМ ЭДТА, рН 7,4.

2. 0,05 М фосфатный буфер, рН 7,4.

3. 2 мМ раствор восстановленного глутатиона, приготовленного на 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,4.

4. Гидроперекись третичного бутила разводят 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,4: 9 мл трет-бутила добавляют к 5 мл фосфатного буфера.

5. 75 мМ трис-ЭДТА буфер, рН 8,5.

6. 20 % раствор ТХУ.

7. 10 мМ реагент Эллмана, приготовленный на метаноле.

Ход определения. Готовят 3 пробы: опытную, контрольную и стандартную. Исходно опытная проба содержит 0,3 мл гемолизата эритроцитов (1:100), 0,2 мл фосфатного буфера с ЭДТА (рН 7,4) и 0,1 мл 2 мМ раствора глутатиона восстановленного. В контрольную пробу вносят 0,5 мл фосфатного буфера с ЭДТА и 0,1 мл 2 мМ раствора восстановленного глутатиона. Стандартная проба содержит 0,5 мл фосфатного буфера с ЭДТА (рН 7,4) и 0,1 мл 2 мМ раствора глутатиона. Все три пробы преинкубируют на водяной бане при температуре 37 °С в течение 2–3 мин. Реакцию запускают добавлением по 0,1 мл гидроперекиси третичного бутила в опытную и контрольную пробы. После 5 мин инкубации в термостате при температуре 37 °С реакцию останавливают 20 % раствором ТХУ, внося по 0,1 мл в каждую пробу, и немедленно охлаждают во льду. В контрольную и стандартную пробы добавляют 0,3 мл гемолизата (1:100), перемешивают. Затем пробы центрифугируют при 4000 g в течение 10 мин. Для регистрации оставшегося глутатиона используют реагент Эллмана – 5,5-дитиобис (2-нитробензойную кислоту). К 2,25 мл трис-ЭДТА буфера (рН 8,5) добавляют 0,6 мл супернатанта и 0,025 мл 10 мМ реагента Эллмана, который реагирует с восстановленным глутатионом, образуя окрашенное соединение с максимумом поглощения при длине волны 412 нм.

Подробный ход анализа ферментативной реакции изложен в таблице 9.

Таблица 9. Последовательность добавления реактивов при определении активности глутатионпероксидазы

Реактивы	Опыт	Контроль	Стандарт
Гемолизат эритроцитов (1:100)	0,03	–	–
Фосфатный буфер с ЭДТА (рН 7,4)	0,20	0,50	0,50
Глутатион восстановленный, 2 мМ раствор	0,10	0,10	0,10
Инкубация на водяной бане при температуре 37 °С в течение 2–3 мин
Гидроперекись третичного бутила	0,10	0,10	–
Инкубация на водяной бане при температуре 37 °С в течение 5 мин
ТХУ, 20 % раствор	0,10	0,10	0,10
Гемолизат эритроцитов	–	0,30	0,30
Охлаждение во льду и центрифугирование в течение 10 мин при 4000 g
Трис-ЭДТА-буфер, (рН 8,5)	2,25	2,25	2,25
Супернатант	0,60	0,60	0,60
Реагент Эллмана, 10 мМ раствор	0,025	0,025	0,025

Измеряют каждую пробу против Н₂О при длине волны 412 нм.

Расчёт активности осуществляют по следующей формуле:

^,

где Е_к, Е_ст, Е_оп – экстинкции соответственно контрольной, стандартной и опытной проб; N – фактор конечного разведения эритроцитарной массы.

Активность фермента выражают в ммолях GSH за 1 мин и относят к 1 мл эритроцитарной взвеси или 1 г гемоглобина.

Литература

Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. – СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. – 104 с.