7.3.3. Спектрофотометрический метод определения активности каталазы в эритроцитах

 

Каталаза расщепляет перекись водорода, об активности фермента судят по убыли перекиси водорода в инкубационной среде.

Реактивы и их приготовление.

1. 0,05 М трис-HCl буфер, рН 7,4.

2. 10 мМ раствор перекись водорода. Концентрацию перекиси водорода в растворе пергидроля определяют по методике, изложенной выше.

Ход определения. Для определения активности каталазы отмытые эритроциты гемолизируют 0,05 М буфером трис-HCl (рН 7,4) в соотношении 1:10. 0,02 мл гемолизированных эритроцитов смешивают с 4 мл дистиллированной воды (разведение 1:2000), добавляют одну каплю 96 % этилового спирта и оставляют на 4–12 ч.

Инкубационная смесь содержит 0,1 мл 0,05 М буфера трис-HCl (рН 7,4), 0,04 мл гемолизированных эритроцитов (разведение 1:2000), 1,8 мл дистиллированной воды (контроль) и 1,8 мл 10 мМ раствора Н2О2 (опыт). Снижение оптической плотности в результате расщепления перекиси водорода в опытной пробе измеряют против контроля каждые 30 с в течение 3 мин при комнатной температуре при длине волны 230 нм. Скорость реакции линейная в первые 3–4 мин.

При расчёте активности используют средние значения изменения оптической плотности за каждую минуту в течение 3 мин:

А = Еср../ 0,071,

где А – количество ммоль Н2О2, разрушенной в среднем за 1 мин при добавлении в инкубационную смесь 0,04 мл гемолизата эритроцитов (1:2 000); Еср – среднее значение оптической плотности, рассчитанной за одну минуту; 0,071 – коэффициент молярной экстинкции Н2О2.

Об активности каталазы в гемолизате эритроцитов судят по убыли перекиси водорода за 1 мин, выражают в ммоль Н2О2/мин и относят к 1 мл эритроцитарной взвеси или 1 г гемоглобина.

 

Литература

Leff J.A., Oppengard M.A., Curiel T.J. et al. Progressive increases in serum catalase activity in advancing human immunodeficiency virus infection // Free Rad. Biol. Med. – 1992. – V. 13, № 2. – P. 143–149.